成纤维细胞预处理过程及三种低温保存方法比较的实验研究

    1 引言

    成纤维细胞是构成真皮的主要细胞,亦是构建组织工程化真皮的种子细胞。组织工程化真皮是指由机体分离出来的成纤维细胞在一种三维生长支架上进行体外复合培养,形成再生的真皮等同物[1]。研究表明,成纤维细胞-支架材料复合培养所产生的类真皮组织,对位于其表层的角质细胞的生长与进一步分化有极为重要的支持作用。通过实际培养表皮细胞膜片移植实验也进一步印证了此点[2]。

    组织工程化真皮的低温保存技术是皮肤组织工程的重要组成部分,对皮肤组织库的建立有重要意义。尽管皮肤的低温保存和临床应用研究已进行了20余年[3~6],但组织工程化真皮的低温保存的研究报道仍很少[7~9],并且不同的支架材料、不同的组织工程化真皮培养时间,其低温保存特性也会有很大的差别。

    当前对组织工程化真皮的低温保存主要有两个方向:其一是先将成纤维细胞接种在三维支架上并培养一段时间后,再将真皮等同物进行低温保存,复温后继续培养形成组织工程化真皮;其二是先将成纤维细胞进行低温保存,复温后再将细胞接种在三维支架上并培养一段时间,最终形成组织工程化真皮。因此实现成纤维细胞的低温保存对组织工程化真皮有着重大的意义。

    目前在有关的科研部门中,一般均采用逐步降温法(利用冰箱进行降温)对其进行保存,因为这种方法对于绝大多数种类的细胞来说都是适用的[10]。为了对成纤维细胞的低温保存方法有更明确和广泛的了解,在介绍逐步降温法的同时,也详细介绍了另外两种低温保存方法:程序降温法(利用程序降温仪进行降温)和玻璃化保存法。

    先对预处理过程对成纤维细胞存活率的影响进行了实验研究,然后采用了三种低温保存方法:逐步降温法、程序降温法和玻璃化保存法,对成纤维细胞进行了低温保存实验,详细介绍了三种方法的操作过程,并从复温后的细胞存活率、降温过程中的温度变化情况、操作时所需仪器设备及所耗时间等方面对三种方法进行了比较。

    2 预处理过程对成纤维细胞存活率影响的实验研究

    预处理过程中对细胞存活率的影响因素包括:低温保护剂DMSO的浓度、预处理时间和预处理温度。探讨在成纤维细胞的低温保存过程中的预处理阶段,以上因素对细胞存活率的影响。

    实验采用的DMSO浓度、预处理时间及预处理温度分别如下所示:

    DMSO浓度(v/v):5%;10%;15%;20%;25%;30%

    预处理时间:5min;10min;15min;20min;25min;30min

    预处理温度:4℃;25℃;37℃。

    实验步骤为:将DMSO与细胞悬液混合,然后将溶液在规定的温度下放置一段时间,最后采用台盼兰染色的方法[10]检测其细胞存活率,细胞存活率(%)=(1-被染色细胞数/细胞总数)×100%。