显微光谱成像分析技术及仪器研究

　　1、显微成像技术研究及发展

　　被称为科学的“眼睛”的显微镜，在科学技术飞速发展的今天，扮演着越来越“出色”的角色。借助她了不起的工作，人类发现了“细胞”，认识了“细胞”，不仅从结构上解剖了生物世界和物质世界，而且进一步阐明了生命功能模块的存在及其繁衍变化的诸多过程，将人眼本不可见或不能分辨细节的微观世界的精妙之处如数家珍般逐一呈现在我们的面前，人类不由得不感叹自然造物是如此的神奇和美丽，“点点滴滴”才是真。

　　“微软”所带来的不只是IT技术本身天翻地覆的革新，信息技术的发达改变了传统的粗略的显微观察方法，高速图像采集和海量的图像存储技术将显微成像技术推进到精细测量、定量分析的科技新境界。世界顶级显微镜制造商德国的Zeiss和日本的Olympus不仅在显微镜各个部件如各种物镜、聚光器、无限远光学系统、精密位移电动调节等做到了极致，而且在显微镜观察和成像的原理方法上不断的进取和探索，如共焦显微镜(Confocal Imaging),激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Imaging)、多色荧光显微镜(Multifluorescence Microscope),荧光能量共振传输(FRET-Fluorescence resonance EnergyTransfer )、多光子(Multiphoton)成像显微镜、荧光相关光谱(FCS-Fluorescence CorrelationSpectroscopy)、荧光寿命成像显微术(FLIM-Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy)等等，如今高档的显微镜不仅可以是一台生物显微镜、一台金相显微镜、一台荧光显微镜，而且可以共焦的、多光子激发的、能量共振传输的、多功能的，它既可以完成各种物质的显微成像观察，也可以通过配置各种激光扫描、共焦针孔、探测器件和操作软件，成为微观定量的光度测量系统。

　　Carl Zeiss大胆地提出要实现All in one，其基本功能要实现在一个系统中可以提供细胞观察的任意组合方法:记录随时间变化的动态的变化过程、多通道的、三维的、可随意选择标记区域和多种信息查询方式的显微观察和成像。在观察过程中通过暂停和继续的间歇尽可能改变任意显微镜参数以满足各种特殊的区域观察，测量其中任意点的位置和距离，计算多个位置点的间距和交角，完成各种特征标记、计数和统计分布等等，在一个系统中，可以完成当今细胞成像观察的您所希望获得的任意功能。如下图(a)选择了两个细胞在一个共焦层面上的具有光谱特征和形态特征的动态观察，细胞的层面位置可以任意选择( z-stack ), (b)为绿荧光蛋白标记情况下细菌体的观察。

　　显微观察与成像的目的就是要将人眼无法分辨和不可清晰分辨的东西通过光学放大从而尽可能地达到适于我们宏观上去认识和观察的目的，显微成像术也经历了从简单到复杂、从二维到多维的不断发展。从我们所熟悉的二维光学成像以及采用数字化技术(数码相机、CCD等)的显微图像分析，到全空间的不同层面的三维成像技术(共焦成像)，我们实现了对被观察样本的空间信息的整体认识，其形态特征分布被广泛地应用于医学、生物学和材料认知等各领域，但是随着科学技术的进步，显微成像己经从空间三维分辨扩展到多维空间，在三维空间增加光谱维即不同波长的光谱显微成像，采用各种特征染色探针标记细胞的不同部分如细胞核、纺锤体、着丝点、细胞质、各种不同荧光蛋白、染色体等，细胞和组织的不同组分即光谱信息的提取和识别就产生了显微观察的第四维一光谱维;其次我们研究随着时间变化时，活体细胞和组织的空间和光谱的动态过程或荧光寿命等生命现象既增加显微成像的第五维一时间维，它特别用于活体样本在规定时间间隔可任意选择位置的显微观察;任何研究都不会是孤立的研究某个位置或者单个的细胞组分，我们所希望获取的是某个对象在特定的环境、特定的时间条件下其形态、功能的特征，并为其界定相对应的解释或者寻找可靠的识别和调节的方法，因此以功能基团为单位的位置、时间、光谱信息的多维组合型显微成像技术如激光共焦、能量共振吸收等为特征的新技术得到了强劲的发展”12’。