线结构光共焦显微成像技术的实验研究

　　1　引　言

　　共焦显微术自20世纪60年代由美国的Min-sky[1]首先提出后,受到越来越多的学者的关注,相继开发了各种各样的基于共焦原理的显微镜。普通光学显微镜受光波衍射极限的限制,分辨率只达到亚微米级,不能够满足生物医学工程、材料科学等领域对更细微的组织结构的观察要求,而共焦显微镜由于采用“共焦”技术,使得成像分辨率大为提高,突破了衍射极限的限制,有很高的轴向分辨能力,可以重构物体的三维信息。激光被引入共焦显微镜后,以其特有的单色性好、亮度高的优点使得共焦显微镜的性能大大提高,产生了激光共焦扫描显微镜,拓展了共焦显微镜的使用范围。

　　目前大多数激光共焦扫描显微镜都使用点扫描共焦成像,扫描系统比较复杂,成本较高。我们创新提出了线结构光共焦扫描显微成像的构想,并设计了一套实验装置。通过线结构光共焦成像的实验,验证了线结构光共焦成像的可行性。

　　2　共焦显微术原理

　　共焦显微术的原理如图1所示。点光源发出的光经物镜后聚焦到物体的表面,再由物体透射或反射后经聚光镜再聚焦到探测器。点光源、物面、探测器前的小孔三者是互相共轭的,因此叫做“共焦”[2]。

　　由于探测器前面放置了小孔光阑,而且小孔位于聚光镜的轴上物点处,非物镜物平面上的杂散光被挡住,只有与小孔共轭的物点发出的光能够被探测器接收,这样探测器的信噪比就大大提高,成像有很高的对比度和清晰度。70年代C J R Sheppard就已经阐明它的横向分辨率是相同相对孔径的普通显微镜的1.4倍[3]。轴向分辨率表示为1·4nλ/NA2[4],其中λ表示照明光波的波长,NA为物镜数值孔径,n为物方介质的折射率。由扫描机构对物体进行xy平面扫描,得到物体一个平面的图像,再进行轴向扫描就可以得到物体多个层面的扫描图像。各层图像再经过计算机图像三维重构处理,就得到整个物体的三维图像。

　　3　线结构光共焦成像实验装置

　　我们在应用“共焦”原理的基础上,提出了线结构光共焦扫描显微系统的构想,并设计了实验装置,该实验光学系统如图2所示。

　　选择632.8nm的氦氖激光为照明光源,激光经扩束准直镜后形成平行光束投射到狭缝光阑1上,通过狭缝光阑1的即为线结构光。线结构光经过辅助物镜1后入射到分光镜光路转折。分光镜位于平行光路中,一方面起到转折光路的作用,另一方面起到滤光的作用。物镜将线结构光聚焦到物平面上,形成线聚焦。物镜有共轴照明和成像的双重功能。从样品反射的光经物镜后再通过分光镜透射,再由辅助物镜2会聚到狭缝光阑2上。狭缝光阑2在CCD的感光面之前,可以滤掉离焦的杂散光,只有处于共焦平面的光才可以被CCD接收。