飞秒激光活细胞微手术研究

　　1　引　言

　　生命科学的发展在很大程度上依赖于对活细胞的加工和操纵。传统的手工操作、机械手操作及近年发展起来的原子力显微镜(AFM)操作技术都是靠机械的接触实现细胞的操纵,对细胞损伤很大,很难进行活细胞内细胞器的操作。激光对生物组织的蚀除在临床上又称为激光外科手术,已广泛应用于对皮肤、软骨等组织[1~3]。飞秒激光的诞生解决了这一难题。2002年,Tirlapur等人[4]用飞秒激光在细胞膜上产生单个的、特定位置的和瞬时的穿孔,允许DNA通过,并保持了细胞的完整性,转染效率达100%。2008年,天津大学采用飞秒激光对酵母细胞进行融合,实现了高效的细胞融合[5]。因此,飞秒激光在生命科学领域已显示出了独特的优越性,并开展了细胞骨架动力学[6,7]、高效基因转染[8,9]和生物模型[10]等的研究。

　　细胞核是细胞的“司令部”,它控制着基因的遗传和细胞的增殖,对其进行高分辨的损伤从而研究微区功能具有重要的意义。2005年,哈佛大学报道了飞秒激光在细胞核内的手术分辨率,在2.8 nJ时为360 nm[11]。关于细胞核微区损伤对细胞活性影响的研究还未见报道。另一方面,对细胞突起的切割可以引起胞外物质通过切口运输到细胞内部,它可以应用于高效的药物投递、基因治疗等,目前也无相关的报道。因此,本文通过自行搭建的飞秒激光细胞手术系统对活细胞的手分辨率进行了研究,观察细胞核的微损对细胞活性的影响,并研究了飞秒激光对嗅鞘细胞的突起进行损伤,细胞活性的恢复对成功实现胞外物质跨膜运输打下了坚实的基础。

　　2　实　验

　　2.1　细胞培养和染色

　　Hela细胞和嗅鞘细胞分别培养在装有完全培养基的培养瓶内,放在37℃、含5% CO2的培养箱里。完全培养基由高糖DMEM、10%胎牛血清、0.292 mg/ml的谷氨酸盐、100 U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素组成。在进行细胞手术前,细胞经过PBS清洗2次,然后传代到特制的细胞培养皿内,最后为了使细胞能够很好地贴壁将细胞培养皿放在培养箱内12 h。特制的细胞培养皿是一直径为35 mm的培养皿,它的底部钻有10 mm直径的孔,然后将厚为100μm的盖波片粘贴在培养皿的底部。在细胞核内手术分辨率研究中所使用的Hela细胞是由南京大学李朝军教授馈赠,它是经过绿色荧光蛋白标记组蛋白的稳定遗传的Hela细胞。在嗅鞘细胞突起损伤的实验中,手术后5 h,采用50μg/mL的PI荧光染料对细胞膜的通透性进行标定,从而鉴定细胞的活性。

　　2.2　飞秒激光细胞手术系统

　　细胞手术分辨率和活细胞损伤所采用的飞秒激光细胞手术系统如图1所示。采用再生放大的钛宝石激光器作为细胞手术的激光源,其输出的激光中心波长为800 nm、重复频率为1 kHz、脉冲宽度为130 fs。入射到细胞培养皿内的激光功率经由偏振片精确的调节,衰减后的飞秒激光经不同数值孔径的显微物镜(NA=0.60和1.35)聚焦到细胞培养皿,通过计算机程序控制三维移动平台的精确运动从而实现细胞特定部位的曝光,光闸可以控制光的通断。因此,通过光闸和三维移动平台协调运动可以实现细胞特定位置的点曝光和线切割。整个细胞手术过程可以通过白光源照明的CCD实时观察。为了实现荧光的激发与观察,采用高压汞灯作为激发源,滤光片实现对激发波长的选择,光闸控制曝光时间。同时,采用同一显微物镜对激发光进行聚焦和荧光的收集,荧光经滤光片后进入CCD实现细胞荧光的观察。