基于同步扫描相机的荧光寿命测量系统研究

　　荧光显微技术是生命科学研究和临床诊断的重要工具.荧光具有多参量特性,荧光光谱可反映样品组分,荧光寿命可反映荧光分子所处微环境信息.通过测量荧光寿命,可间接获得荧光分子所处微环境内的生理生化参数[1],如pH值、离子浓度(Ca2+和K+等)和氧压等.荧光寿命测量和成像结合可定量获取样品功能信息,具有直观、准确和信息全面等优点,已在生物物理、生物化学及临床医学诊断等领域获得广泛应用[2-4].

　　近年来,随着多光子激发技术的发展[5-7],荧光光谱和荧光显微技术也取得较大进展.双光子激发采用近红外光作为激发光源,具有对样品中焦点以外区域的光漂白和光损伤小、荧光成像穿透深度深、荧光激发波长范围宽、激发光与荧光容易分离等优点.结合荧光寿命测量,双光子荧光显微技术具有更高的时间分辨率和空间分辨率.基于扫描相机的荧光寿命测量方法近年日趋受到关注,渐显强大优势[8-11].同步扫描相机具有时间分辨率高、测量时间短、灵敏度高、适于高重复频率微弱荧光信号的测量、可提供随时间连续变化的信息以及能记录荧光衰减全过程等优点[9, 10].本文建立了一台基于同步扫描相机的双光子激发荧光寿命显微测量系统.和文献[12, 13]中重复频率为1MHz的扫描相机系统相比,该系统采用重复频率为76MHz的同步扫描相机,可大幅提高光能利用率.该系统具有时间分辨率高、非线性小、扫描速度可调以及灵敏度高等优点.利用钛蓝宝石飞秒激光器和一组标准具对系统的时间分辨率、扫描速度和扫描非线性等参数进行了标定,并测量了荧光染料Rose Bengal的寿命.实验结果表明,该系统在不同扫描速度下具有皮秒量级的时间分辨率和良好的扫描非线性特性,且荧光寿命的测量精度高.这种基于高重复频率同步扫描相机的荧光寿命显微测量技术,可在生物医学研究及临床诊断等领域得到广泛应用.

　　1　实验系统及工作原理

　　本文所建立的双光子激发荧光寿命显微测量系统如图1.该系统由钛蓝宝石锁模飞秒激光器、荧光显微镜、样品台、同步扫描相机、光锥耦合CCD实时读出系统以及计算机等组成.扫描相机采用S20多碱阴极,光谱响应范围为185~900 nm,灵敏度为100μA/lm.

　　钛蓝宝石锁模飞秒激光器输出光脉冲的重复频率为76MHz,脉冲宽度为120 fs,波长在700~980nm范围内连续可调.激光脉冲经30/70分光镜被分成两束.其中一束为主光束,通过双色分束镜DM后由显微物镜汇聚到样品上,对样品进行双光子激发,样品所发出的荧光通过显微物镜收集,由镜头f1成像到扫描相机的光电阴极上.另一束触发光束通过PIN转换成电信号,经滤波和放大后产生一高压正弦波作为扫描相机的扫描信号.光电阴极发出的光电子在正弦偏转电压作用下进行偏转,将时间衰减变化的荧光信号转化为扫描相机荧光屏上空间位置变化的荧光信号,最后,利用光锥耦合CCD实时读出系统记录荧光衰减信号.通过对荧光衰减曲线进行拟合分析,可得样品的荧光寿命.