蛋白质/多肽的毛细管电泳-激光诱导荧光检测分析方法发展

　　1前言

　　作为一类重要的生命活性物质，对蛋白质/多肤进行特异性辨识及检测对研究生命的起源和进化，生物的新陈代谢和遗传等具有十分重要的意义。毛细管电泳(CE)以其多样的分离模式、高效、快速等特征，已俨然成为蛋白质/多肤类样品的最重要、最有效分析方法之一二CE的检测光程一般较短，采用紫外检测灵敏度较低，在一定程度上限制了其应用领域的拓宽。激光诱导荧光检测器(LIF)的引人，在毛细管电泳检测发展史中具有里程碑式的意义，它突破了由于检测灵敏度不高所造成的瓶颈，使分析灵敏度提升近3一4个数量级，CE一LIF已被用于单分子检测分析方法发展。

　　自1985年Cassmann等(“首次将LIF与CE联用以来，CE一LIF已取得了长足的发展。基于不同的考虑，陆续有一系列相关综述发表，本着实现蛋自质/多肤快速、高选择性、高灵敏度检测的初衷系统总结了相关的研究工作;唐波等综述了各种蛋白质分子荧光探针的应用对CE一IJF常用激光源、基本仪器设备、不同衍生模式等加以讨论，并着重阐述了几类常用衍生试剂的性质及其应用。

　　许多天然蛋白质/多肤本身并不具有荧光特性或自身荧光强度很弱，需要使用荧光试剂对其进行衍生，因此如何选择和开发相应的荧光试剂就成了实现高效检测的关键之一。考虑到实际操作过程中激发光源-检测器往往是既定的，荧光试剂的选取需要根据待测样品性质、现有设备条件作出相应调整，故本文将各荧光试剂以激发光源归类，总结了几类常用荧光衍生化试剂的特性，并在此基础上对近几年蛋白质/多肤类样品的毛细管电泳一激光诱导荧光分析方法发展加以系统综述。

　　2蛋白质/多肤衍生化试剂的特征

　　衍生化的目的是使用一种试剂与待测样品结合，使产物能够发射特定波长的荧光，可进一步采用荧光检测器进行检测，有效提高分析灵敏度。由于蛋白质、多肤具有特殊的结构与功能，因此所选用的荧光衍生化试剂也应具有特定的结构及物理化学性质。

　　蛋白质/多肤空间三维结构复杂，并含有大量的活性基团，这些官能团是否都能与荧光试剂键合形成完全、单一的产物值得考虑。事实上，由于位阻效应荧光试剂很难与其所有位点结合，衍生产物往往是各异的。尤其在低浓度、慢反应速率下，会生成大量结合不同份荧光试剂的副产物，质荷比不一，这也是导致谱峰展宽的重要原因之一。

　　氨基、碳基和琉基是蛋白质/多肤上常用来参与反应的三种活性基团。含氮基团不仅包括蛋白质/多肤物质的N端，也包括赖氨酸、精氨酸的氨基残基。赖氨酸的自由氨基与蛋白质/多肤的N端往往存在竞争，竞相与荧光试剂发生反应;而对于精氨酸而言，若控制反应条件在pH值7一10之间的碱性环境下，仅精氨酸的伯胺、仲胺基团被衍生。C端的拨基活性相对较弱，在衍生化前往往需要进行活化，故此法不常用。在半胧氨酸的琉基上引人荧光标记物也是可行的，此类琉基活性染料已经商品化，但因半恍氨酸残基的含量较少，故其运用也受到限制