双光子激光扫描显微镜中折射率失配引起的图象变形研究

　　0　引言

　　双光子激光扫描显微镜(Two-photon laserscanning microscopy,简称TPLSM)是基于非线性的双光子激发现象从而实现对荧光样品的三维扫描成象功能的显微镜1.这种非线性的双光子激发过程与线性的单光子激发过程相比,由于双光子激发所产生的荧光强度与激发光的光强平方成正比,这就使双光子激发具有很高的空间局域特点,从而可以不使用共焦小孔(confocalpinhole)就可以获得较高清晰的荧光图象2～5.因此,与共焦激光扫描荧光显微镜相比(confocallaser scanning microscopy,简称CLSM ),TPLSM以其更高的空间分辨率、高的信噪比和简单的光学设计等优点,正日渐成为对生物活细胞和组织进行观察、分析和处理的最重要的成象工具之一1,6.

　　然而,由于显微镜光学设计和使用条件的复杂性,几乎所有的光学显微镜在使用过程中都存在着不同程度的图象变形的现象,这些变形除光学设计本身的原因外,大都来源于生物样品的散射、折射率失配等因素.目前,在具有三维成象功能的显微镜中,光切显微镜(optical sectioningmicroscopy和CLSM已经被证实都存在着图象的变形,并且已经做了大量的研究工作7,8.TPLSM往往使用近红外的飞秒激光作为激发光源,由于红外光具有较强的穿透性,它能探测到生物样品表面下200μm深以下的荧光图象,生物样品散射对TPLSM所造成的图象变形相对于单光子(50μm以下)的CLSM要小些,因而在TPLSM图象中折射率失配是引起图象畸变的主要原因.目前,人们已经发展了一系列有效的方法来纠正折射率失配所造成的图象畸变9,10.由于这些方法在实际使用过程中不易操作,因而在实验中TPLSM的图象变形往往没有受到足够的重视.过去的关于折射率失配引起TPLSM图象变形的研究大都是在共焦小孔存在的情况下以油浸物镜和干燥系物镜为主要研究对象8～10.目前TPLSM已广泛应用于活体和离体的生物样品的研究中3,5,6.由于生物样品具有较弱的荧光的特性,考虑到双光子激发的空间局域特点,在实际使用过程中为了提高TPLSM的探测灵敏度往往不使用共焦小孔3,5,6,因而TPLSM图象的变形程度将更加严重.另外因为生物样品的研究往往是在水溶液中进行的,其折射率大小非常接近水,水浸物镜是最好的选择.然而,在三维扫描成象中,不可避免的要在光轴方向移动样品.在没有盖波片(coverslip)的情况下,这一方向的运动可能通过溶液的粘滞力等因素带动样品的移动,这种情况显然会导致测量和观察误差,在高速扫描中,甚至无法观察样品.因而在使用水浸物镜进行生物样品的观察时,一般会在样品和物镜间插入盖波片.由于折射率的失配,这往往会给激发光路带来球差,从而导致TPLSM荧光图象的变形.