数字共焦显微技术

　　1　引　言

　　在用传统的荧光显微镜进行成像时存在着一个无法克服的问题,即聚焦图像与离焦模糊图像混合在同一图像中,致使人们很难看清所感兴趣平面的图像。为了解决这个问题,人们一直在不断地努力研究以便找到解决方法。1987年,世界上第一台激光扫描共聚焦显微镜研制成功,它立即成为医学、细胞生物学领域最先进和强有力的分析仪器[1]。随后,激光共焦显微镜被广泛应用于医学、生物学、材料科学、半导体科学和地质学等领域。激光共焦显微镜的基本原理是在荧光显微镜的成像基础上,采用汇聚的激光束在样品中激发荧光,且利用激光扫描装置进行扫描成像。其优点是聚焦平面上的标志被激光照明且发射荧光,而离焦平面受到针孔的限制不发射荧光,这样得到的图像只是样本的光学横断面即聚焦平面的图像,因此克服了传统荧光显微镜图像模糊的缺点。但激光共焦显微镜同时存在以下缺点:由于激光具有非常高的强度,当用激光激发样本时会产生很高的光漂白率,因此降低了荧光分子的荧光发射能力。另外,激光共焦系统结构复杂,采用了非常昂贵的硬件系统,因此其价格也非常昂贵。

　　近年来,随着数字图像处理技术及其算法的不断发展,一种更好的方法———数字共焦显微技术已经问世并且发展非常迅速。其特点是在传统荧光显微镜的基础上利用数学算法来去除图像中的离焦模糊,可取得好于激光共焦显微镜的图像质量,它可以定性、定量、定时、定位地对样品进行分析和测量。由于不采用激光照明,它克服了激光共聚焦光漂白的缺点。由于数字共焦显微系统结构简单,其核心在于软件,因此价格比较便宜。基于以上特点,目前数字共焦显微镜倍受人们的关注且得到了广泛的应用,取得到了相当好的实验结果[2、3]。

　　2　数字共焦显微系统的原理与结构

　　数字共焦显微系统的原理是在标准荧光显微镜的基础上,利用数学算法即图像解卷积算法计算出离焦面上的荧光图像成分,并且从原图像中去掉它,只留下人们感兴趣的平面即聚焦平面的图像。这里所谓“共焦”是指系统采集到的图像只来自于样本的一个剖面。因此,数字共焦显微镜就是在一台标准的荧光显微镜上配有CCD相机、高性能的计算机和综合处理软件(该软件能通过解卷积计算方法去除图像中的离焦信息),从而实现对样品的共焦观察与测量。如图1所示,一台完整的数字共焦显微系统一般由以下部分组成:

　　2.1　硬件部分

　　(1)荧光显微镜

　　荧光是指分子在光能量的照射下,电子从基态被激发到更高的能态,当这些电子从高能态返回基态时,它们能发射出较照射光波长更长的光,即荧光。荧光显微镜利用物质的荧光特性,采用荧光物质如荧光素和若丹明对样品进行荧光染色,对染色后的样本进行荧光成像和观测。目前,高性能的荧光显微镜主要有Leica、Zeiss、Nikon和Olympos,这些显微镜均可实现全自动和计算机控制。几乎所有的部件,包括物镜的选择,滤波器的选择以及Z轴工作台的位置,均可实现计算机自动控制。