DNA原子力显微镜成象条件的研究

    原子力显微镜是具有原子级分辨率的新一代显微镜,在生命科学中,尤其在生命的遗传物质—DNA的精细结构研究中,得到了极大的关注.近年来,成功地获得了DNA、RNA以及DNA-蛋白质复合物结构图象^[1~4]. AFM与传统的X射线衍射、核磁共振、旋光色散等方法相比,具有分辨率高、制样简单以及在保持生物活性条件下成像等优点.

    虽然AFM已经成功地获得了DNA的图象,但仍存在一些问题.针尖对样品的作用力很容易损伤柔软的生物组织,特别是在空气中,由于探针和样品分子表面有一层水膜,扫描时探针要穿透这层水膜,从而产生强大的毛细力易使柔软的生物大分子遭到损坏,影响图象的质量.人们尝试通过不同的途径来解决这一问题,在液体中成象受到了普遍的重视,这样可以减少针尖对样品的作用力.本研究探索了在空气、水和乙醇中DNA成象的比较,并对AFM针尖结构进行了扫描电镜观察,以求从成象环境和仪器本身来进行分析.

    1　材料与方法

    1. 1　材料

    质粒pQE30为QIAGEN公司的产品,是全长3462bp的双链环状DNA. pQE30在大肠杆菌JM105中复制,用QIAGEN Plasmid Midi Kit提取纯化,其A260/A280为1.85.

    1. 2　样品制备

    将pQE30分别溶于无菌去离子水和无水乙醇,使其终浓度为100μg/ml.取20μl pQE30水溶液,滴加到新鲜剥离的云母表面上,吸附1 min,用滤纸条沿液滴的边缘将残液吸去,氮气吹干,待观察.取100μl pQE30水溶液和乙醇溶液,分别加入液体池中,用原子力显微镜进行观察.

    1. 3　原子力显微镜观察

    三种样品成象所用的原子力显微镜型号为Digital Instrument公司生产的MultiModeAFMNanoscopea,扫描管为J型,成象模式为敲击模式(tapping mode).微悬臂的力常数k为0.12 N/m,测量前用紫外灯对其照射5 min进行消毒.图象在室温条件下获得,扫描速度为1.0~2.5 Hz.所有图象只采用Flatten Auto处理,以消除慢扫描方向上的低频噪音.成象同时记录力曲线,比较AFM针尖和样品间相互作用以及成象结果.

    1. 4　AFM针尖的扫描电镜观察

    分别取用过数十次和新的AFM的Si针尖各1个,由于其具有导电性,可在扫描电镜下直接成象,型号为Hitachi S520.

    2　结果与讨论

    在液体中对DNA成象需要加入一定浓度的二价阳离子,这是由于载体云母表面和DNA分子均带负电荷,相斥作用使DNA分子难以固定在云母片上而影响成像,二价阳离子起“搭桥”作用固定DNA分子,如图1所示.

    2. 1　不同成象环境DNA图象的比较

    质粒DNA一般存在线型、松弛型及超螺旋型三种拓扑结构^[5].图2是在不同环境对pQE30DNA进行AFM观察的结果.由图2可见pQE30DNA分子呈松弛的环状结构,但环的直径有所不同;另一部分DNA分子呈颗粒状,这种形态的DNA为超螺旋DNA,但没有观察到明显的线型结构,一般在温度较高或被酶切断后,质粒才呈线状结构. DNA分子链的表观宽度在空气中为21~25nm(图2a),在水溶液中为18~22 nm(图2b),在乙醇中为15~19 nm(图2c).