海洋红藻R-藻胆蛋白的扫描隧道显微镜研究

　　藻胆蛋白是红藻、蓝藻、隐藻和某些甲藻中光合作用中的捕光色素。到目前发现的藻胆蛋白有四大类,分别是藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、异藻蓝蛋白(APC)和藻红蓝蛋白(PEC),其中每一大类又根据其性质的不同分成不同的类型,如藻红蛋白分成R-藻红蛋白、C-藻红蛋白、B-藻红蛋白和b-藻红蛋白。藻胆蛋白在光合生物的进化过程中占有极其重要的位置,研究它的结构与功能,对于了解藻类光能吸收与传递的机理具有重要的意义。加之藻胆蛋白含量丰富,易于分离,在常温下非常稳定,藻胆蛋白是目前研究的最清楚的光合色素[1]。过去用电子显微镜、X-射线衍射等手段对藻胆蛋白的结构进行了大量的研究,到目前为止,已得到六聚体的C-PC[2-4],三聚体的PEC[5]和六聚体的B-PE[6]的高分辨X-射线衍射结构,但由于电子显微镜分辨率较低,而X-射线衍射需首先得到蛋白质晶体,因此到目前为止种类繁多的藻胆蛋白仅有为数很少的几种得到了X-射线衍射结果。

　　扫描隧道显微镜(STM)和原子力显微镜(AFM)是八十年代初刚发明的新兴的表面分析技术,已广泛用于生物学研究[7]。我们首次将STM应用于藻胆蛋白的结构研究,已得到了螺旋C-藻蓝蛋白分子高分辨率的STM图像[8],本文报道多管藻R-藻红蛋白的STM研究结果。海洋红藻多管藻(Polysiphonia urceolata)采自青岛汇泉湾畔。将藻体浸在蒸馏水中让其自溶解,过滤得到藻胆蛋白的粗提液。然后用羟基磷灰石柱层析纯化藻胆蛋白。R-藻红蛋白(R-PE)用20mM的磷酸缓冲液(pH7.0,0.2M NaCl)洗脱,重复洗脱四次,即得到纯化的R-PE。用岛津UV-240分光光度计测定吸收光谱。根据最大吸收峰的OD值计算藻胆蛋白的含量。

　　在STM实验之前将藻胆蛋白对5mM(pH7.0)的磷酸缓冲液透析48小时,除去溶液中的NaCl,实验时将透析液稀释到大约5μl/ml,吸取5μl样品溶液滴于刚揭开的高定向石墨(HOPG)上,吸附30s,多余的溶液用滤纸轻轻吸干。STM实验用中国科学院化学研究所生产的CSTM-9100型STM在室温大气下进行,采用恒流模式,用电化学方法自制钨针尖。扫描时隧道电流为0.70nA,偏压为256mV。文章中的所有STM图像都是原始图像。

　　图1是多管藻R-藻红蛋白的吸收光谱,多管藻的R-PE有三个吸收峰,分别为498nm,545nm和565nm,最大吸收峰565nm处的峰值与278nm处蛋白本身的吸收值之比为3.82,说明这R-PE已经纯化。

　　图2是多管藻R-PE的STM图像,多个R-PE分子面对面聚集在一起形成类似于藻胆体杆的结构,说明纯化的R-藻红蛋白也倾向于以聚合体的形式存在,这也是生物大分子的共同特性。聚集态的形成主要取决于R-PE在溶液中的浓度及在HOPG上的吸附时间。在聚集体的边缘,分布着数个单个的R-PE分子,分子与分子间的微小差异是由于蛋白分子在HOPG表面上不同的吸附方式所致。