高效液相色谱-核磁共振联用技术

　　前言

　　核磁共振(NMR)已经成为获得有机物详细结构信息的有力手段，它能够很方便地提供不同分子结构上的细微差别，包括同分异构化合物和立体异构化合物。但是，核磁共振要求分析样品是纯物质，对于混合物进行分析得到的结果往往很困难，在很窄的化学位移里面要区分不同物质的信号在很多情况下是不可能的。因此在使用核磁共振检测前，需要对混合样品进行分离纯化等前处理。目前已经与核磁共振联用的分离手段有：高效液相色谱-核磁共振联用(HPLC-NMR)、超临界流体色谱-核磁共振联用(SFC-NMR)、超临界流体萃取-核磁共振联用(SFE-NMR)、毛细管电泳-核磁共振联用(CE-NMR)。其中高效液相色谱(HPLC)在复杂样品中的分离已经得到广泛应用，通过调整色谱条件可以用于分离不同的样品，如果将NMR与HPLC联机使用，就能大大简化样品的分离检测过程。

　　HPLC 广泛用于复杂混合物的分离，并且与多种检测器联用。常用的检测器有示差折光检测器(refractive index)、紫外吸收检测器(UV)、荧光检测器(fluorescence)、电化学检测器(electrochemicalproperties)、蒸发光散射检测器(ELSD)，以及在药代动力学研究中常用的同位素标记检测等。但是，这些检测器一般都只能提供非常有限的待测物的结构信息。而核磁共振(NMR)能够很好地获得待测物的结构信息。与传统的离线NMR检测手段相比，使用在线NMR检测可以防止样品在分离后至 NMR 检测之间的结构变化，并能够缩短NMR检测时间[1-5]。

　　HPLC与NMR的联用，已经成为日常分析应用中的常用工具，取得了巨大的成功。随着各种HPLC-NMR 体系的不断建立，HPLC-NMR在混合物尤其是未知物的结构鉴定中的应用已经越来越广泛。

　　1 HPLC-NMR 的技术发展

　　最早的在线HPLC-NMR试验是在20世纪80年代初，由Bayert[6]等人报道的，他们在分析中使用了两种模式，即在流模式(on-flow)和停留模式(stop-flow)。使用在流模式的灵敏度低于微克量级;使用停流模式的灵敏度略高于纳克量级。1988 年，Allen[7]等用 19FHPLC-NMR分析低级醇和苯酚中的对氟苯甲酸。1989年，Caswell[8]等使用HPLC-NMR成功地分析了中级精馏油中的各种组分。随着HPLC-NMR的发展，对核磁探头的硬件要求越来越高，同时需要开发抑制溶剂峰的脉冲序列，对数据处理的软件要求也越来越高。目前在HPLC-NMR应用的技术上还存在若干问题需要解决。

　　1.1 HPLC 洗拖液对NMR的影响

　　使用HPLC进行分离时，很多情况下洗脱液都是含有大量1H的溶液，而待测样品的浓度是很小的。要从高浓度的洗脱液中检测到微小的样品信号，需要抑制洗脱液的信号。HPLC 的洗脱液往往组分复杂，在使用梯度洗脱时，每个组分的含量还要随着时间改变，因此抑制洗脱液的信号有相当的难度。使用氘代的溶剂作为洗脱液，可以很好的抑制洗脱液信号，从而降低对NMR动态范围的要求。但是氘代试剂的昂贵价格限制了在洗脱液中的大量使用，往往应用在微柱分离中。使用不含有1H的CCl4作为洗脱液，也是一个方法，但CCl4在很多情况下不是合适的洗脱液，而且对环境有相当大的污染。如果能够使用普通洗脱液进行分离，在NMR探头中使用氘代试剂进行检测，则是最理想的方式。这个方法已经在超临界流体色谱 - 核磁共振(SFC-NMR)中得到应用。SFC 中使用的洗脱液是超临界 CO2，不会在NMR检测中有信号响应。在实际的HPLC分离中，常见的洗脱液有甲醇，乙腈等。甲醇和乙腈在1HNMR中的信号都是一个单峰，因此抑制它们的信号并不困难。但是1H-13C的耦合会在13CNMR中产生很多卫星峰，一般使用照射去耦抑制这些信号。