大黄中氨基酸的DNFB柱前衍生化高效液相色谱测定

　　1 前言

　　中药大黄为蓼科多年生草本植物的根及根茎。大黄中含有蒽醌类、苯骈丁酮类、黄烷醇类、酰基葡萄糖类等化合物，有很强的抗菌及抗病毒作用;生大黄还有很好的保护胃肠粘膜，预防肠道细菌易位，中和并减少内毒素吸收的作用及较强的泻下作用[1-2]。

　　氨基酸的摄入能够有效提高人体免疫力，在临床上已用于肝昏迷的治疗。大黄保肝利胆的功效可能与此有关。熊灰岩等[3]在青海野生大黄中分离分析出苏氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、色氨酸等五种人体必需氨基酸;他们[4]在对唐古特大黄叶柄的营养成分分析过程中也检测到常见的18 种氨基酸，总量为4084.43mg/100g，人体必需氨基酸含量占总氨基酸含量的比例达39.04%，对健康影响比较大的赖氨酸、组氨酸和精氨酸的含量较高

　　氨基酸的高效液相色谱分析可以分为直接分析、柱前衍生化、柱后衍生化等种类[5]。与其他两种方法相比，柱前衍生化具有所用设备简单。方法通用性、稳定性好等特点，已经得到较大的发展。柱前衍生化的氨基酸高效液相色谱分析方法一般采用C18 柱，梯度洗脱的分离模式，UV检测。经异硫氰酸苯酯、2,4-二硝基氟苯(DNFB)是常用的衍生化试剂[6-7]。由于氨基酸衍生物结构相似，对液相色谱分离的选择性要求较高。本文在前期工作基础上[8]通过升高色谱柱温度调节分离选择性，结合线性梯度洗脱的分离模式，调整分离选择性，发展了一种氨基酸的2,4-二硝基氟苯柱前衍生化高效液相色谱分析方法，也将其用于大黄中氨基酸含量的测定。

　　2 试验部分

　　2.1 仪器与药品

　　高效液相色谱系统(大连依利特分析仪器有限公司)：UV230 +紫外- 可见检测器，P230 高压恒流泵，ZW 色谱柱恒温箱，EC 2000 色谱数据处理工作站，Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm I.D.5μm)。

　　18 种氨基酸标准品(BDH Chemicals Ltd PooleEngland);2.4-二硝基氟苯(中国医药上海化学试剂公司) ;磷酸二氢钾、无水乙酸钠、冰乙酸、N,N- 二甲基甲酰胺、硼砂、硼酸、氢氧化钠(分析纯，天津市科密欧化学试剂开发中心);甲醇、乙腈(色谱纯，Fisher Scientific);超纯水( Milli-Q )。

　　氨基酸标准溶液：称取Tyr 1.0mg，其余16种氨基酸各5.0mg，用pH 9.0 硼酸缓冲溶液溶解，定容至100mL，4℃冰箱保存。

　　大黄样品溶液：野生鲜大黄采自大连龙王塘。根部洗净，去皮，90℃烘24h，研成粉状。

　　称取粉状大黄0.1g于安瓿瓶中，加入3mL6mol/L的盐酸，110℃密封水解24h。将样品从安瓿瓶中完全转入蒸发皿中，80℃水浴蒸干。用pH9.0 硼酸缓冲溶液多次洗涤蒸发皿，洗液转入50mL容量瓶中定容;用0.45 μm 微孔滤膜过滤后备用。