增强型荧光显微镜的量化处理及测试

　　引言

　　用荧光显微镜观察细胞可以得到荧光物质在细胞内的分布图象。常规荧光显微镜只能定性地得到细胞的荧光图象，不能定量地给出发光的强度数值，因而 只能观察发光图象有明显变化的生理过程，而无法判断一些图象发光强度变化不大的生理过程。随着现代生物学与医学的进一步发展，对实验要求不断提高，要求荧 光显微镜能给出一定精度的定量数据，以定量分析细胞内部物质分布的量值以及在生理过程中物质分布的改变.本文中提出了一种在普通国产倒置生物显微镜基础上 作改进，用高灵敏度弱光成象探测器作为图象接收器的新型高增益荧光显微镜，采用CCD摄象机及图象采集卡、计算机做后极处理部分，对细胞的荧光图象进行量 化处理，使通过CCD采集的荧光图象中的每一点都可根据其灰度标定曲线找到对应的发光强度值。这项工作是以往所没有的，但是在生物医学等科研实验中又是迫 切需要的，因而有很高的应用价值。

　　1增强型荧光生物显微镜

　　系统框图如图1所示。光源经集光准直后透过激发滤光片产生激发光照射到细胞样品上，更换不同的激发滤光片可得到不同的激发波长，以满足不同荧光 试剂的需要。细胞激发出的荧光由物镜收集后分成二路，一路进入目镜以便观察，另一路由截止滤光片滤掉杂散光只透过荧光，再经象增强器放大。仪器中采用了象 增强器作为输出图象的光放大，其增益为4000。左右，这样就大大提高了仪器的灵敏度，使得仪器可以接收极弱的荧光图象，较常规荧光显微镜的探测灵敏度提 高了3—4个数量级，降低了对光源及荧光标记物浓度的要求。仪器中激发光和受激荧光在同一轴上，传输方向相同。为避免激发光透过吸收滤光片到达象增强器的 阴极面，将背景光放大，使荧光图象淹没在明亮的背景中，采用了暗视场照明器，并且数值孔径大于物镜的数值孔径，这样透过细胞的激发光在物镜收集的成象光锥 之外，物镜收集激发出的荧光，视场中只有细胞的荧光图象及暗背景，提高了图象的信噪比。放大后的荧光图象由藕合透镜输入到CCD象面，图象采集板采集到计 算机，并由计算机对输入原始图象进行处理，得到处理后的细胞荧光图象或根据标定的图象灰度数据与输入光强关系曲线得到图象中每一点的原始及修正发光强度 值。

　　2量化处理与测试

　　选用由中国计量科学院标定的宽量程微光照度计KZD一I型作探测器，其光强探测范围在光 源采用75W超高压汞灯，电源电压220V.暗场照明器数值孔径0.83~0.91.物镜放大倍率10倍，数值孔径0.25。激发滤光片选用ZBI有色玻 璃，其中心波长在400nm左右，最大透过率为72%。截止滤光片选择的是CB58O有色玻璃，透过58Onm以上的长波部分。象增强器为国产一代三级管 3XZ25/25，有效光阴极直径25mm，阴极灵敏度310拼A八m，等效背景照度电 源电压6v，亮度增益40000倍.摄象机采用敏通公司的MTV一1801黑白CCD摄机，最低照度0.05lx，电源电压12V，信噪比大于46dB. 断开CCD的自动增益控制，手动调节增益为一定值，不再改变。图象板为中国科学院自动化研究所生产的CA5300图象采集卡，A/D转换为 loMHz，sbit，图象采集分辨率512x512，256灰度。