激光诱导荧光毛细管电泳DNA检测系统信噪比分析

　　0　引言

　　随着人类基因组计划完成, DNA分析与测试需求不断增长.毛细管电泳[1-2]分离效率高,样品消耗少,易自动化,已有多种商品化仪器,广泛应用于DNA测序、限制性DNA片段分析,蛋白质、氨基酸分离等生物分离分析研究.在微芯片上蚀刻微通道,实现芯片毛细管电泳成为微阵列芯片[3]后的研究热点[4-5],但仍有很多问题需要解决,因此用于DNA分析仍处于实验室研究阶段·结合共焦原理,激光诱导荧光(laser-induced fluorescence,LIF)检测可以达到很高分辨率和灵敏度,并对检测物质具有选择性,因此广泛用于高性能DNA检测[6-7],其检测限(limit of detection,LOD)可达pmol/L量级.

　　激光诱导荧光检测多使用反射式结构收集荧光,激发光的会聚和荧光的收集使用同一物镜,布局简单,装调方便.正交型检测系统[8-9]使激发方向和收集方向垂直,以降低激发光背景噪音,但其强度仍然比荧光强得多,需要高性能滤色片滤色,有必要寻求最佳荧光收集方向,优化信噪比.本文通过理论及实验考察了激发光在毛细管中由DNA电泳筛分介质引起的散射,及毛细管内外壁折射反射引起的背景噪音,旨在寻求最佳荧光收集方向.

　　1　系统简介

　　多通道激光诱导荧光检测毛细管电泳DNA分析系统原理如图1.488 nm激发光经扩束镜(beamexpander),窄带激发光滤色片(filter 1),调节反光镜(mirror 1),会聚透镜(focus lens)照射到毛细管(capillary),毛细管固定于一维扫描平台,以实现多通道毛细管检测,提高DNA分析通量.毛细管中的染色DNA迁移到激发光照射的检测窗口时,染料分子发出荧光,由物镜(objective)收集,经调节镜(mirror 2),由荧光滤色片(filter 2)滤除激发光波长的背景噪音,经共焦小孔滤除空间背景噪音,到达光电倍增管(PMT).通过荧光信号就可以分析DNA样品.图中为激发光与荧光收集方向呈正交分布.最普遍采用的是共轴检测方式,激发光会聚和荧光收集使用同一个物镜,利用二色镜分离.

　　2　系统背景噪音与信号分析

　　2.1　背景噪音来源

　　LIF系统的背景噪音主要来源于[10]:1)毛细管内外壁的折射和反射,会聚的激发光入射后在毛细管内外壁上经过了多次折反射[11];2)电泳分离DNA的筛分介质引起瑞利散射;3)筛分介质的非弹性喇曼散射;4)杂质粒子引起的杂散光.其中4)是不确定因素,这里不予考虑,3)的强度低,可以忽略.因此这里主要考察1)和2).

　　2.2　背景噪音角度分布

　　激发光被聚焦到毛细管中心的筛分介质后,由于折射和反射引起各个方向分布不均匀的噪音.建立由激发光源(488 nm,Ar+laser),会聚透镜(10X显微物镜)和充满筛分介质(4%LPA,折射率1.39)的弹性熔融石英毛细管(折射率1.46)组成的系统模型.利用TraceproTM软件通过光线追迹计算得到毛细管内的激发光光强分布.为了考察毛细管内径对噪音分布的影响,利用直径为20μm的光斑对内径为50、75和100μm,外径为365μm的毛细管分别进行模拟,计算各个角度的光强,所得分布曲线如图2.图中只给出了部分角度的光强,其它角度由于噪音过大,已超出本文讨论范围.结果表明:1)对于内径50μm毛细管,75°方向背景噪音最低,当用一定数值孔径的物镜收集荧光时,此角度可以获得最低背景噪音;2)随着毛细管内径增大,折反射噪音分布向前向和后向倾斜,靠近正交方向有较大角度的低背景噪音范围.荧光检测中为了提高检测灵敏度,常常使激发光斑略小于毛细管内径.