共聚焦激光扫描显微镜系统及其在生物学研究中的应用

　　一、引言

　　共聚焦激光扫描显微镜系统(ConfoealLaserSeanMieroseopeSystem)是光学显微镜技术，激光扫描技术，计算机图象处理技术结合在一起的高技术设备。

　　有关共聚焦显微镜的报道首先见于1985年。当时瑞典斯德哥尔摩皇家技术学院宣布建成了一台称为Phoibos的特殊仪器，可用来观察活细胞的 连续横断面，从而找到了显示活细胞三维结构图象的新方法。该仪器工作时，生物样品作缓慢的垂直移动，以便使光束在样品的不同深度上聚焦，横断面的厚度为 1--2um，激光束扫描得到的图象利用计算机处理、显示和贮存。这一则报道引起了生物学界的轰动。正是瑞典与英国在1985年发明了在固定的显微镜光路 中驱动光束扫描的方法，极大地改进了共聚焦显微技术，使共聚焦显微镜系统变成了实用的产品。近年来除瑞典的上述产品外，还有英国Boi--Rad公司的 LasersharpMRC型共聚焦激光扫描显微镜，德国OPton公司和Leica公司也分别推出了LsM系列和CLSM型共聚焦激光扫描显微镜系统。 最近美国的TracorNorthern公司推出了比较廉价的以普通白光为扫描光束的共聚焦显微镜，其优点是可以得到真彩色的生物样品图象。

　　二、共聚焦激光扫描显微镜的工作原理及性能

　　共聚焦显微镜利用激光扫描技术，其照明光由光源经过光源针孔再聚焦，在样品中某一深度形成一个光点。其反射光经聚焦后需通过观察针孔才能到达成 象面(imageplane)。在样品中高于或低于焦平面的反射光以及杂散光都遮挡掉。由于针孔非常小，挡住了光点的衍射环，致使共聚焦显微镜的分辨率超 过常规光学显微镜分辨率的极限。与两个聚焦光点相应的光源针孔和观察针孔必须对准，并要同步动作(operatinginsynohrony)才能获得显 微图象，故称为共聚焦。激光束的扫描和控制以及图象数据的采集和加工都由计算机完成。图1是共聚焦成象的原理图。

　　与常规的光学显微镜相比，共聚焦显微镜的分辨率优于0.2um，比光镜高1.4倍，即介于光镜与电镜之间。共聚焦激光扫描显微镜还具有Z向观察 能力，其深度分辨率可达0.1um。而且激光在样品中聚焦的深度可调，因此可以对厚生物样品进行光学“切片”观察。光学切片的方向既可平行于XY平面，又 可平行于Z轴的任意方向。由于共聚焦技术使样品中的杂散光不能到达成象面，极大地提高了观察生物样品的清晰度。共聚焦显微镜特别适用于荧光染色的标本的观 察。由于激发光对样品的照射是以扫描方式进行，可以大大减少为产生显微荧光图象所需的激发光照射时间，这就为提高激发光的强度创造了条件。再加上共聚焦显 微镜的空间分辨率很高，因此可以得到比常规光镜清晰得多的显微图象。共聚焦显微镜系统与电压敏感或离子敏感的荧光染色技术结合，可以深入脑组织或离体的脑 片样品中进行高清晰度的观察。观察样品的厚度可达500um[1]，适用于脑功能及其可塑性(plastieity)的广泛研究领域。