微束激光基因转移仪的研制

　　0　引言

　　激光微束穿刺法(lasermicrobeam puncturemethod)是利用激光脉冲,将外源基因导入植物的技术,也是当前先进的转基因技术之一[1~2]。该方法是利用能量高度汇聚的激光微束作用于细胞膜引起细胞膜的可逆性穿孔,从而导入外源DNA。与基因枪和化学方法相比,激光微束穿刺法可用外植体种类较广泛,不受基因型的限制,转化处理过程较基因枪法处理细胞损伤小,激光穿刺孔在1μm左右,其关闭与修复仅需1 s,细胞活性恢复快。微束激光穿刺法也可用于动物细胞的转化,所以,该方法具有实际推广价值。

　　转基因技术是在亚细胞层次,完成实验需要经过十分细微的操作,但一般的激光穿刺都是由实验人员在显微镜下,手动操作机械微操作器完成。由于传统的手动操作设备,没有计算机控制,不能实现自动或半自动操作[3~4]。其缺点是:①实验人员需要经过较长时间的专业培训,工作效率和实验的成功率都较低;②不能满足生物样品多样性的实验要求,对于不同生物需要重新设计实验,实验设计比较复杂。所以我们设计了自动控制平台,根据生物的多样性,系统可以设定不同的扫描参数。采用计算机控制实现对样品的自动化扫描,扫描速度和位置可调、细胞定位准确、重复性好。

　　本研究的目的是从自动化程度上提升原有的设备,使之更有效地满足激光穿刺转基因实验的要求。在国家“863”项目支持下,经过努力终于达到了预期目标,研制出“微束激光基因转移仪”样机。

　　1　微束激光转基因仪系统组成

　　整个系统包括光刀光源、光刀的聚焦成形光路和显微观察光路、自动样品平台及其控制系统和图像监测、采集和处理系统等主要部分。其组成结构如图1所示。

　　光刀光源经分束镜反射后,经显微镜物镜,聚焦在样品上,形成光刀。计算机控制自动平台在X-Y平面按所设定轨迹运动,实现对样品的自动扫描;动态操作过程由物镜显微成像,通过一个彩色CCD采集动态图像并在计算机屏幕上进行实时观察和记录。

　　1.1　光刀光源及光路部分

　　脉冲Nd: YAG激光器调Q输出的激光为波长1.06μm的红外光。采用非线性晶体对红外脉冲激光进行倍频与和频后,成为激光穿刺转基因所使用的350 nm波长紫外激光。然后通过衰减器调节到适当的强度,最后经特殊镀膜的反射片反射进入显微镜物镜,会聚到样品上进行穿刺。He2Ne激光器发射的632.8 nm红色激光,用于光路调整过程的准直与指示。

　　激光器能单脉冲和重复频率工作,可以达到较高的脉冲重复频率、输出功率高、激光质量好,光束发散角可达到衍射极限,器件体积紧凑。激光器所使用的冷却水为闭循环的蒸馏水。冷却水箱通过致冷压缩机进行温度控制,保证冷却水的温度恒定,以满足系统对稳定性的要求。