蛋白质晶体结构的研究

　　应用电子显微学方法研究蛋白质薄晶体结构，通常使用负染色方法。然而它存在缺陷:负染色剂在电子束照射下会发生变化，如醋酸铀体积减少达15%，这会引起蛋白质表面移动(P.Un-win)。其次由于负染色液与氨基酸残余侧链基因的化学作用。会出现正的或负的染色，使得图象难以解释(W.Chiu)。最后负染色的样品大约只能获得15-20的分辨率。如不进行染色，也有问题:象衬度非常弱;存在真空损伤—蛋白质从含水状态到电镜真空中，因干燥而引起损伤;最后是幅射损伤—蛋质晶体对电子束非常敏感，典型的蛋白质晶体，大约在le/的电子剂量时就开始被破坏(Stenn)。这样的剂量远小于通常观察时的剂量。为解决这些问题，A.Klug等人采用下列方法:用相位衬度成象;用葡萄糖取代水介质，由于葡萄糖不挥发，有利于真空保存，同时不含重原子，不妨碍蛋白质内部结构的成象(P.Unwin);用低剂量，如小于1e/的剂量进行观察和照相，以避免电子束对蛋白质的损伤。这种方法获得的象的衬度和信噪比都极低。用肉眼看是一无所有的(见图C)。A.Klug等人用计算机图象处理方法把被噪音遮盖的结构信息萃取出来并重构出结构。为了重物样品结构需要测定付氏函数的振幅和相位。在原理上，从象的付氏变换可获得振幅和相位。然而由于电镜的象差和不稳定性，从象得到的付氏函数振幅是被包络函数所调制的(Hanszon)，因此，图象数据需要解调。但在蛋白质晶体对幅射损伤非常敏感的条件下解调是困难的(Frank)。替代的办法是测定同一样品区域的电子衍射谱的反射点强度去计算付氏函数的振幅(P.Unwin)。本文介绍作者在研究蛋白质薄晶结构的做法和初步结果。

　　样品制备:把过氧化氢酶溶于PHS.6，10%的NaCI中，使浓度为lomg/ml，在4℃下透析24小时，就有薄晶生成。把B.Subtilisa一淀粉酶溶于PHg一10的氨水中，浓度大约为35mg/ml，室温中在0.02MCaCL2(用50%丙酮配成)中透析1-2天，就有微晶生成。用一滴晶体悬液和

1%的葡萄糖溶液1:1混合，然后取5ul混合液滴于铜网上，五分钟后用滤纸吸去残液，即制成不染色的葡萄糖包埋的蛋白质簿晶样品。支持膜是在微筛膜上复盖上一层薄碳膜，再喷上稀疏而均匀的黄金颗粒的薄膜。电镜观察的是孔中簿碳膜支持的薄晶。黄金颗粒用于帮助聚焦。整个样品的厚度应用小于30nm。以能满足弱相位体的条件。

　　电子衍射与成象:衍射与成象是使用带有侧插测角台的JEM--100CX透射电镜。它是经过改装的:可测定的电子剂量最低达0.05e/(在物面)，并且可以进行离轴聚焦和能适应低剂量技术的其他要求。进行低剂量衍射时，使用高激励的第一聚光镜电流和小的第二聚光镜光栏(20um)，从而获得非常低的剂量(<0.05e/)。操作首先使衍射稍失焦，屏幕上出现一个极低倍，高衬度的象，在这条件下寻找合适的样品。选到合适的薄晶后，即插入选区光栏，迅速聚焦并调节剂量至约0.le/，随后记录下来。曝光时间约20秒。低剂量成象必须使用与衍射相同的样品区域。使用相位衬度成象不同物镜光栏。第二聚光镜光栏改用200um。放大倍数为30000-40000X(保证底片含有足够的单胞)。借助黄金颗粒进行离轴聚焦。调节剂量为1~2e/进行拍摄，曝光时间2--4秒。接着记录两个高剂量的象:其一是保持低剂量象的成象条件不变，仅使记录象的剂量为30-50e/。这象用于测定成象参数。其二是象的放大倍数较低，使象中既含薄晶也含碳膜的高剂量象，用以估计薄晶厚度。上述低剂量衍射谱及成象用Kodakso-163底片记录，显影用全浓度D19，在20℃显影12分钟。记录高剂量象用Kodak4489底片，显影用1:2浓度Dig，在20摄氏度显影4分钟。