原子力显微镜在DNA研究中的应用

　　1 引 言

　　1986年Binnig与斯坦福大学的 Quate和IBM苏黎士实验室的Gerber 共同发明了原子力显微镜(AtomicForce Microscopy, 简称AFM)[1],AFM是一种不需要导电试样的扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscopy,简称 SPM)。这种显微镜通过其尖端只有一个原子大小的探针在非常近的距离上探索物体表面的情况,便可以分辨出其他显微镜无法分辨的极小尺度上的表面细节与特征。由于它的出现,直接观测微观世界的大门被打开了。这种显微镜能以空前的高分辨率探测原子和分子的形状,使用这种显微镜时能够最大程度的保证试样在观察时不被破坏并能实现原位(in situ)研究。所以,AFM 问世以后,它在生物大分子的表面结构和功能的研究中,都得到了广泛地应用,特别是应用在DNA 结构和功能的分析中[2-6],AFM 能够直观的观察DNA 的表面结构以及 D N A 和其它生物分子如蛋白质作用后的结构演变情况。

　　2 材料与方法

　　2.1 材料

　　本研究中主要采用了两种 D N A ，线性 D N A -λDNA(华美生物工程公司,上海)和环状的 DNA -质粒DNA (pGEM-3Zf(+), Promega Inc.,USA)。

　　2.2 样品制备

　　DNA 样品主要分散在具有原子级平整的云母片上[7]。将 DNA 分子均匀分散在衬底上有多种方法，如分子梳、动态分子梳、电场法、吹气法、流体固定法、旋转法等，相对来讲，旋转法比较简单，本研究主要采取旋转法制备DNA 样品[8]。首先在简易离心机的转盘上粘上新解理的云母片，将 DNA 原液稀释成 5～20ng/μL的DNA 稀释溶液,取稀释后的DNA 溶液20 μL并滴加在云母上，然后打开离心机，调节转速，使液滴滑过衬底，再将Milli Q水滴在样品上，调节转速，使水滴缓慢甩出，用洁净气体吹干。用镊子取下云母片干燥后即可用 A F M 观察。

　　3 结果与讨论

　　本研究使用SHIMDZU SPM 9500 J3 型原子力显微镜，采用空气中的动态模式(Dynamic mode)。自然状态下的λ - D N A 分子是呈相互缠绕的卷曲状或团状，它的线状结构不容易在AFM 中观察到。在不需要任何设备的情况下,直接将 DNA 溶液滴在云母片上干燥后制备的λ D N A 样品会出现比较严重的杂乱堆积的情况,如图1A 所示。但是经过采用旋转法制备的DNA 样品就可以完全展开,如图1B 所示。胡钧等研究人员就采用这种完全展开的 DNA 进行纳米操纵[9],如 DNA 的切割、移动、卷曲等等。

　　同线性的λ-DNA 相比,质粒DNA 的制样就没有这么麻烦,只需要将DNA 溶液稀释,然后直接滴在稀释的云母片上就可以了, 如图 2 所示, 其中显示的是质粒DNA 的环状结构。在用 AFM 研究 DNA 的表面形貌时,远没有本文介绍的这么简单,限于文章篇幅,很多问题没有详细讨论。比如说云母表面吸附力大小,DNA 溶液浓度等对 DNA 样品分散的影响等。图 1 中,采用的DNA 的浓度是一样的,而 A 图中的 DNA 明显比 B 图中的 DNA 稠密,这是因为裸云母对 DNA 的吸附力不是很大,旋转法制样时的离心力会带走很大一部分吸附不好的DNA 溶液,所以留在云母上的 DNA 溶液相对较少,分散也较好。为了增加云母的吸附力, 可以考虑在制样时,加入一定比例的金属离子,如镍离子等。