激光扫描共焦荧光显微系统研究

引　　　言

激光扫描共焦荧光显微镜(LSCFM)具有很高的纵向分辨率,它能形成高分辨率的二维层析象和三维立体象[1],使其在生物医学领域得到了广泛的应用。

我们建立的激光扫描共焦荧光显微系统是以重庆光仪厂XQF显微分光光度计的主机为基型,增设了激光光源,扩束系统,光学扫描系统,光电探测,电子控制及电脑图象处理系统。为了探测到被激发的微弱的荧光,需注意下列三点:(1)须采用高质量的扫描成像系统。(2)共焦小孔和扫描器件的优化设计[2,3]。(3)特殊的图像补偿方法。现就前两个问题进行一些研究。

一、激光扫描共焦荧光显微系统

激光扫描共焦荧光显微系统由光学扫描系统和图像采集、处理两大部分组成。

光学扫描系统采用Ar+激光器作光源,经光学系统会聚成衍射极限的共焦光斑入射在试样上。被激发的荧光通过光学系统成像,被光电倍增管接收,实现了共焦成像。为了得到试样的三维图像,须对x,y,z三个方向进行扫描,利用工作台x,y方向扫描完成平面粗扫工作,以便于精确定位,其精度为2μm,可调范围为50mm×30mm。工作台z方向扫描决定层析的厚度,扫描精度为1·5μm,扫描试样最大厚度可达100μm,可连续采集几十帧图像。用上海激光技术研究所生产的检流计振镜作行扫描器,用36BF003型步进电机作为帧扫。图像采集分256×256和512×512两种方式,采集一帧256×256图像时间为1s,采集一帧512×512图像需4s,二维扫描各点之间的定位误差小于象素间隔的10%。

图象采集处理系统包括光电探测信号处理,信号采集及电脑图象处理,用GDB-223型光电倍增管接收被激发的荧光,微弱的荧光信号经放大后通过数据采集系统进入带有协处理器的386微机,采集后的层析图像经图象变换,平滑,增强,特征提取等处理;考虑到激光束穿越试样进入深层及荧光从试样深层返回过程中发生的吸收和散射,以及离焦和折射率变化产生的象差等因素造成图像的失真和湮没等因素,应该进行图象补偿,修正和恢复,将层析图象重构成三维图,以显示被测物的三维形态及内部结构。

二、激光扫描共焦荧光显微光学系统成象原理及参数确定

设计成的激光扫描共焦荧光显微光学系统如图1所示。488nm,514nm的激光从Ar+激光器1发出后经准直扩束镜2变成一束平行光,平行光经分束器3进入扫描光路。反射镜4振镜5的空间位置关系见图2所示,平行光经帧扫描反射镜4反射到行扫描振镜5,完成光线的二维扫描,进入转换物镜6,而后将平行的扫描光聚焦于物镜的象面7,并充满物镜12的入瞳进入物镜12,转换物镜6的作用还将返回的荧光象以平行光形式出射,并将孔阑11的象成在行扫描振镜上。光路中附加镜组是原显微分光光度计引出光路用,在共焦系统中对光路作了改动,改为从目镜上方引入。设计中,须考虑该组透镜对后继系统产生的象差及光瞳衍接的影响。从试样13激发出的荧光经物镜成象在物镜的象面上。通过控制和调整转向棱镜8的位置,可使全部或部分光线返回扫描光路。若采用全部透射式返回的荧光经物镜6,进入扫描光路,在分束器3处反射进入集光镜14,被针孔15及光电倍增管16接收。该实验光路的主要参数列于表1。