共聚焦激光扫描荧光显微镜扫描系统研制

　　1　引　言

　　共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scan-ning microscopy,简称CLSM)及其在此基础上发展起来的双光子激光扫描显微镜(two_photonlaser scanning microscopy,简称TPLSM)以其优异三维成像能力在生物学、半导体工艺及三维微细加工等诸多领域得到日益广泛的应用[1_2]。共聚焦激光扫 描荧光显微镜(CLSM)光学部分的基本原理如图1所示。点光源发出的光通过分光镜和物镜聚焦到样品上,并在样品中激发出荧光。荧光由物镜收集并通过分光 镜会聚到共焦小孔上,并由探测器检测。由于共焦小孔、点光源和物镜焦面处于共轭位置,因此非焦面的荧光和杂散光将被共焦小孔阻挡。通过逐点扫描工作台上的 样品,便可得到样品的荧光图象。

　　扫描方式的选择和设计是共聚焦显微镜研制的重要环节。自共聚焦扫描显微镜出现以来,其扫描方式主要有三种:工作台扫描(stage scan-ning)[3],光束扫描(beam scanning)[4]和转盘扫描(spinning disk )[5]。工作台扫描是指激发光的会聚焦点静止而承载样品的工作台进行二维平面运动实现逐点扫描。光束扫描与其相反,通过在光路中加入扫描振镜使光束发生 偏转,从而实现焦点在样品上的扫描[6]。转盘扫描是利用快速旋转的Nipkow Disk来实现光束对样品的光栅式扫描。

　　目前,利用双光子及其共聚焦显微镜来进行三维光学高密信息存储及三维光学微细加工的研究工作已成为微型电子器件和光子器件的重要方法 [7_8]。三维光学微细加工要求聚焦脉冲的宽度要小,光斑的空间轮廓形状光滑。光束扫描方式由于在扫描过程中使光束发生偏转而产生球差,从而容易导致光 斑的空间轮廓形状凹凸不平。Nipkow Disk扫描方式在利用飞秒激光作为光源时,将不可避免地造成飞秒激光脉宽的变形和加宽,同样也无法提供高质量的光斑。所以我们开发了一套专门用于此研究 方向的工作台扫描的共聚焦显微镜扫描系统,它的扫描过程不改变光束的参数从而使光斑质量达到最优。

　　本文主要报道了利用压电陶瓷驱动器较高的位移分辨率和基于柔性铰链的微动工作台组建的共聚焦荧光显微镜的扫描系统的原理与设计,对工作台的有关性能如扫描范围、非线性及其动态性能进行了测试,并通过实验获得了良好的效果。

　　2　共聚焦激光扫描荧光显微镜的扫描系统

　　研制的共聚焦显微镜的扫描系统由两部分组成,一是计算机控制电子系统(CLSM控制器)(图2);二是微位移工作台(图3)。

　　扫描系统的基本工作原理是:计算机通过D/A转换器和高压放大电路产生两路独立的峰值在0~120V的扫描电压,波形为三角波或锯齿波(图 2)。这两路扫描电压分别驱动两个压电陶瓷驱动器,使它们分别在两个方向(x和y)上产生相应的伸缩运动。一个微位移工作台(图3)将嵌入在它内部的压电 陶瓷驱动器的伸缩运动放大,并带动微位移工作台及其上面的样品实现二维扫描。