利用基于扫描相机的荧光寿命成像显微技术研究细胞周期

　　1　引　　言

　　细胞周期是细胞从第一次分裂结束产生新细胞到第二次分裂结束所经历的全过程,分为间期与分裂期两个阶段。其中间期按照脱氧核糖核酸(DNA)的合成又分为DNA合成前期(G1期),DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期)。借助显微镜已经能了解细胞周期里细胞的形态变化以及某些细胞器的显著变化,但对于细胞内生物大分子在细胞周期内的反应和作用却知之甚少[1]。

　　荧光寿命成像显微(FLIM)技术将荧光显微与时间分辨荧光测量技术相结合,通过逐点测量样品的荧光寿命,提供细胞或组织样品荧光寿命的空间分布[2]。由于荧光寿命的测量不受激发光强度、荧光团的浓度和光漂白等因素的影响,且不受其他影响强度测量因素的制约,只与荧光团所处的微环境有关[3,4],因此,通过对样品进行荧光寿命成像,可以对分子所处微环境的许多生物物理、生物化学参数如pH值[5,6]、离子浓度(如，K+等)[7,8]、氧压[8,9]、溶液疏水性及猝灭剂[10](如碘化物、丙烯酰胺)等的分布进行定量测量。常用的荧光寿命测量和成像技术包括时间相关单光子计数器[11]和像增强器[12],前者通过将时间相关单光子计数器和共焦扫描成像相结合,具有高的时间和三维空间分辨能力;而基于门控像增强器的荧光寿命成像技术采用宽场成像方法,具有成像速度快的优点。扫描相机具有皮秒量级的时间分辨率,因此利用扫描相机测量荧光寿命,并将其与荧光显微技术结合,具有高的时间分辨率和空间分辨率,以及成像速度快等优点,是活细胞内蛋白质分子之间相互作用以及细胞微环境变化研究的重要工具[13,14]。

　　绿色荧光蛋白(GFP)的荧光寿命对溶质的浓度很灵敏,其荧光寿命与荧光蛋白所处溶液折射率的平方是线性反比关系,GFP的荧光寿命会随着有机或无机分子的增加而缩短[15,16]。当细胞处于细胞周期的不同进程时,它内部会发生一系列的生化变化。在G1期,细胞合成大量大分子物质,其中包括某些G1期特有的核糖核酸(RNA)和蛋白质,以及复制DNA所需要的若干前体物和酶分子。在S期,细胞消耗G1期的某些酶和蛋白质用以合成新的DNA和组蛋白等物质,在G2期,细胞合成某些蛋白质和RNA分子,为细胞进入有丝分裂提供物质条件。本文利用基于扫描相机的FLIM技术,观察转染GFP的HeLa细胞,主要记录了处于分裂期的HeLa细胞的荧光寿命图像,进而探讨了引起荧光寿命变化的生物机制。

　　2　实验系统和方法

　　2.1　实验系统

　　实验所用的FLIM系统采用滨松公司的C4334型扫描相机,系统整体结构如图1所示,该系统由皮秒二极管激光器、荧光显微镜、扫描相机、扫描振镜系统以及计算机等组成。由于要对GFP转染的细胞进行成像,采用输出波长为470 nm的皮秒二极管激光器,脉冲宽度为130 ps,输出功率为30 mW。受扫描电路的限制,皮秒脉冲激光器的重复频率为2 MHz。用重复频率为50 Hz的三角波驱动X方向扫描振镜Gx,对从皮秒脉冲激光器输出的光脉冲进行线扫描,并通过与奥林巴斯IX-71显微镜耦合的中间光学系统,将线扫描光束聚焦到样品上对样品进行激发,样品所发出的荧光被显微物镜收集,透过双色镜后成像到扫描相机的光电阴极上。用步进扫描信号驱动Y方向扫描振镜Gy,对样品进行扫描方向垂直于Gx的步进线扫描,以获得对整个样品的测量和成像。扫描相机对一维的荧光信号进行时间分辨,最后通过CCD保存到计算机里,通过Gy的步进扫描以及图像处理软件,就可以得到细胞的荧光寿命图像。