荧光测钙装置中单色激发光源的设计和应用

　　引 言

　　细胞内自由钙离子浓度([Ca2+]i)及其变化在细胞生理活动中有着重要的作用，在不同生理条件下测定活体细胞的钙离子浓度是细胞生物物理研究的一个重要内容[1]。由于以荧光标记法测定活体细胞[Ca2+]i具有快速、无损伤等诸多优点，故以荧光标记法为基础的活细胞钙离子浓度检测系统在目前得到了广泛应用，其基本原理如图1。单色激发光源发出激发光，通过耦合系统引入荧光显微镜，并聚焦到样本平面，激发细胞中的荧光探针发出荧光，采用光电倍增管(PMT)和 CCD 采集并记录荧光信号。

　　为了实现荧光测钙功能，要求单色激发光源满足要求：1) 输出的激发光波长可以连续调节;2) 由于荧光测钙实验中所用的荧光探针的平均吸收波长的峰值是从紫外(300nm)到黄绿光(595nm)，所以要求单色激发光源在此波长范围内输出的能量满足实验需要;3) 在保证输出能量的前提下，提高光谱纯度[2]。针对以上三个要求，本文介绍了一种用于荧光测钙的单色激发光源(Monochromator)的设计。

　　1 设计要点

　　单色激发光源的设计主要包含三方面的技术：照明光源的确定、分光元件的选取以及会聚物镜的设计。

　　1.1 照明光源的确定

　　单色激发光源中照明光源的选择取决于荧光探针的吸收光谱，实验中所用荧光探针平均吸收波长的峰值范围是 300~595nm，常见的具有这些光谱的强光源有高压汞灯和氙灯[3]。高压汞灯光度强，弧长短，能量较集中，但其光谱不连续，有的波段强度明亮[4]，使用时受到谱线的限制。高压短弧氙灯很好地克服了这个缺点，其发光光谱与太阳光谱相近，是连续光谱[4]，波峰在 450~500nm 之间，在整个需要的波长范围内(300~595nm)光谱平缓，在采集不同的单色光时不会发生明显的能量波动;操作方便，启动即燃;发光过程中弧光稳定，色温不变，且光通量、辉度都很高，使用寿命长，因此我们采用氙灯作为照明光源。

　　1.2 分光元件的选择

　　从短弧氙灯的连续光谱中，选取某个波长的光波作为激发光是本系统的一个重点和难点。目前，单色激发光源中的分光元件根据其工作原理不同可分为两种：滤光片和光栅。采用滤光片分光的单色光源系统简单实用，成本低，光谱特性由滤光片得到有效保证，但是它只能根据所选用滤光片的特征，输出某几种特定波长的单色光，无法对波长进行连续调节。光栅式单色光源系统有效地克服了上述缺点，它的光谱分辨率很高，在光学扫描器的驱动下，可以实现波长的快速、连续调节。

　　光栅的调节是设计此单色激发光源系统的关键，因为光源的单色性、波长切换和稳定性都由它来保证。我们采用闪耀光栅来选择波长，由高精度的光学扫描器控制光栅旋转。由于闪耀光栅有效地克服了没有色散的零级谱占据大部分能量的缺点，使光能量从干涉零级主极大转移并集中到某一级光谱上去，从而使衍射效率大大提高[5]。如果入射光线以任意角i 入射到光栅表面，此时光栅能量分布的函数为