高数值孔径二次谐波显微术的分子取向探测

　　0　引言

　　二次谐波显微术(Second Harmonic GenerationMicroscopy)是一种利用聚焦光场与样品相互作用时产生的二次谐波信号进行成像的新型光学显微成像技术.二次谐波显微术不仅具有三维空间分辨能力,同时还可以避免荧光标记物对活性生物样品的光毒作用以及光漂白现象.近些年来,二次谐波显微术成为显微成像领域中的一个研究热点[1-6].

　　Ⅰ型胶原纤维是生物组织中能够产生二次谐波的一种物质,通常为柱状结构.由于二次谐波的相干特性,受激产生的二次谐波强度与胶原纤维的取向有强烈的依赖关系,在利用二次谐波显微术探测胶原纤维分布时,可以通过分析二次谐波强度的变化规律获得有关胶原纤维取向的信息[1,4-6].

　　在实际应用中,为实现高分辨率成像或探测,经常需要使用高数值孔径(Numerical Aperture,NA)的显微物镜以减小激发区域.高NA物镜的紧聚焦作用将导致退偏现象的出现,焦点区域光场的偏振方向相对于入射光的偏振方向会发生明显改变[7],光场轴向分量对二次谐波强度的影响也不可忽视[8],而目前对高NA二次谐波显微术的取向探测特性研究很少.本文在矢量衍射理论的基础上计算聚焦光场的三维分布,根据格林函数法求解二次谐波光场,利用坐标变换表示胶原纤维的取向,着重分析了NA、胶原纤维极角不同取值时二次谐波强度随胶原纤维取向的变化规律.

　　1　理论模型

　　如图1,一束偏振方向沿x轴的线偏振光入射到一无像差的物镜上,焦点附近光场的三维分布可以表示为[7,9]

　　聚焦光场与位于焦点区域的胶原纤维相互作用产生二次谐波极化场,当胶原分子的对称轴沿x轴(即与入射光的偏振方向一致)时,激发出的二次谐波极化场为[8]

　　孙启光等人曾测量了生物组织的二阶非线性极化率张量[10],根据他们的实验结果,式(4)中二阶非线性极化系数的取值可为:当胶原分子对称轴偏离x轴时,可以利用坐标变换将电场分布转换到以胶原分子对称轴为x轴的新坐标系中[11]

　　式中ψ、θl分别是胶原分子对称轴相对于原坐标系的方位角和极角.假设胶原纤维取向与胶原分子对称轴一致,这也意味着ψ、θl的取值反映了胶原纤维的取向.从式(4)~(6)可以看出,当胶原纤维的取向发生改变时,相应的二次谐波极化场也随之改变.

　　二次谐波极化场产生的辐射相干叠加构成二次谐波光场,在慢变振幅条件下,这一过程满足非均匀波动方程[12]

　　式中I是三行三列的单位矩阵,V是样品的体积,G(R-r)=exp (ik2|R-r|)/(4π|R-r|)是标量格林函数.