荧光谱线分布对共焦荧光显微镜分辨率的影响

　　0　引言

　　共焦扫描显微镜一经提出,就受到人们的关注.近10多年来,其理论研究和应用研究都取得了很大进展[1~9].共焦显微镜与普通光学显微镜相比具有极其明显的优点:能对物体的不同层面进行逐层扫描,从而获得大量的物体断层图像,可以利用计算机进行图像处理;具有较高的横向分辨率和纵向分辨率;对于透明和半透明物体,可以得到其内部的结构图像.在理论研究方面,绝大多数文献都只是讨论了荧光波长等于激发波长[3~8]或者单个荧光波长[1,8]这种情况,没有讨论荧光谱线分布和色散系数对共焦荧光显微镜分辨率的影响.事实上,荧光谱线分布有一定的范围,会导致色散,研究荧光谱线分布对共焦荧光显微镜分辨率的影响是必要的.本文导出了荧光谱线分布的荧光功率传输函数、三维脉冲响应函数,数值计算了荧光谱线均匀分布和色散系数对共焦荧光显微镜分辨率的影响.研究结果显示:与采用单一荧光中心波长的分辨率比较,共焦荧光显微镜的横向、纵向分辨率随着荧光谱线范围的增大和色散系数增大而下降,采用响应谱线范围小的探测器,可以改善横向分辨率、纵向分辨率.

　　1　荧光谱线分布的三维脉冲响应函数

　　荧光共焦显微镜成像系统如图1.对于面源S(υs)、面探测器D(υd),根据文献[9]的结论,可以写出图1所示的激发波长为λe、荧光波长为λ0的共焦荧光显微镜系统荧光功率传输函数为

　　式中,h(υ)是物镜L的三维脉冲响应函数;O(υp)为荧光物体的物分布函数,υp是扫描点的位置矢量.

　　υ=(υx,υy;u)是光学坐标矢量.坐标变换为

　　式中sinα为物镜数值孔径.

　　一般来说,以激发光波长为λe单位的光学坐标矢量υe和以荧光波长λ0为单位的光学坐标矢量υ的关系为

　　根据成像理论,成像系统中像的光强分布是物的光强分布函数与系统的脉冲响应函数的卷积,因此,由式(1)得到图1的成像系统的三维脉冲响应函数为

　　考虑到荧光具有一定的谱线范围[λ1,λ2],荧光谱线分布函数一般有高斯分布和洛伦兹分布,为了了解谱线分布对分辨率的影响,先考虑谱线均匀分布即g(λ,λ0)=1,λ∈[λ1,λ2];探测器的谱线响应也是均匀的,即D(λ,λ0)=1,λ∈[λ1,λ2],中心波长与荧光一致·只适用于单一荧光波长的式(3)需要改写为

　　与单一波长的情况比较,增加了一个因子g(λ,λ0).

　　D(λ,λ0),两者的乘积取决于波长范围小的;若探测器谱线响应范围大于荧光谱线范围,荧光谱线范围以外探测器是没有响应的,故这里处理为荧光谱线范围小于探测器谱线范围,通过荧光谱线范围研究探测器谱线响应范围对分辨率的影响,式(4)表示对一定荧光谱线范围积分.对于点源和点探测器,一定荧光谱线分布的三维脉冲响应函数为