生物发光法细菌快速检测仪的研制及应用

　　1　引　言

　　细菌检测在食品卫生、疫苗质控等众多领域有着重要的应用[1-2],传统的检测方法是培养计数法,该方法需要至少24 h的细菌培养,检测速度慢,无法满足现场快速检测的需求。为实现细菌快速检测,研究者提出了多种检测方法,包括酶标抗体法(ELISA)[3-4]、聚合酶链反应法(PCR)[5-7]等,但这些方法一般需要大型检测设备,且操作复杂、检测成本高,仍无法满足现场快速检测的需求。

　　ATP生物发光法用于细菌检测,具有检测速度快,操作简便等优点,自1949年McElroy将其首次用于微生物检测以来,该技术引起了国内外学者的广泛关注。Bautista使用ATP生物发光技术对牛奶中的细菌总数进行测量[8],DortheS A将ATP生物发光法用于卡介苗快速检测[9]。目前,市场上也出现了一些ATP生物荧光检测仪,但由于被测样品的多样性和复杂性,这些仪器在检测实际样品时,其检测范围和检测准确度都有待提高[10]。

　　本文基于ATP生物发光方法,研制了一台专用检测仪表,结合自制的生物传感器[11],形成了一套完整的活菌数快速检测系统,用于大肠杆菌标准品溶液检测,检测光强结果与培养计数结果相关系数良好,同时获得了相对光强和细菌浓度关系曲线。针对实际样品检测中存在的问题,提出了相应的数据处理改进算法,用于食品中细菌快速检测,获得了良好的检测结果。还将其用于卡介苗活菌数快速检测,使该检测系统的应用领域扩展至疫苗质控领域。

　　2　检测仪设计

　　2.1　检测原理

　　所有活菌细胞中都含有ATP而且含量大致相当[13],细菌裂解后胞内ATP释放,与荧光素-荧光素酶发生反应,产生微弱荧光,荧光光强与细菌浓度成比例,通过检测荧光光强可推算出细菌浓度值。

　　2.2　检测仪系统结构

　　该检测仪主要包括光学检测模块和电路模块两部分,其系统结构框图如图1所示,其中光学检测模块包括生物传感器[11]及光电检测器;电路部分包括处理器、信号采集等核心器件以及按键、显示、存储等外围器件。光电检测器在电路模块的驱动控制下,检测生物传感器所产生的微弱荧光信号,并将其转换成电信号输出。电路模块将采集到的模拟电信号转换成数字信号并进行处理,根据预设算法,得出最终检测结果并显示、存储。

　　2.3　光学检测模块

　　由于生物发光强度极其微弱,光学检测模块设计需充分考虑屏蔽外界光及电磁干扰[11],并选择高灵敏度的光检测器,其结构设计如图2所示。为屏蔽干扰,实现微弱光信号检测,生物传感器及光电检测器均安装在铝制密闭结构中。图2中左侧为生物传感器[12],右侧为光电检测器,通过直径12 mm通光孔相连。选用小型光电倍增管(H5773-02 ,日本滨松光子)作为光电检测器,其光学响应波长为500~600 nm,尺寸仅为50 mm×25 mm×18 mm,灵敏度高,适用于小型光学检测仪表。在通光孔处安装凸透镜,用于增强光线会聚,以提高检测灵敏度。生物传感器上部分为反应试剂存储区,下部分为光学敏感池,被测样品加入到生物传感器后,首先与存储区反应试剂反应,释放出ATP,然后进入光学敏感池,与敏感池中荧光素、荧光素酶等发光试剂反应,释放出微弱荧光信号,经凸透镜汇聚,到达光电倍增管检测区。