激光共焦扫描显微镜及其应用

　　1　概　述

　　我们知道,高分辨力和高衬度一致是显微镜设计者和使用者所致力追求的。然而普通光学显微镜受衍射极限制约,要想提高分辨力,必须使用大数值孔径的物镜。但是使用大数值孔径的物镜观察样品时,像的对比度会明显下降。如果对样品进行染色,其染料又可能杀死活的试样。因此用普通生物显微镜很难对活的生物组织如细胞、细菌等进行动态观察[1]。而生物医学及材料科学的发展又对显微镜提出了更高的要求,不仅希望有更高的分辨力,而且希望能对样品进行无损层析,进而能观察其三维图象。这是普通显微镜所不可能实现的。而基于共焦原理的激光共焦扫描显微镜却能满足以上要求,从而使传统的显微镜有了新的发展。

　　共焦成像原理是由M Minsky等在50年代提出的成象思想[2],由于受技术条件限制,直到80年代后期,随着激光技术、计算机图象处理技术的迅速发展,才使人们逐渐认识到其重要性,并且发展成性能稳定的产品。

　　激光共焦扫描显微镜是集共焦原理、激光扫描技术和计算机图象处理技术于一体的新型显微镜,是一种典型的高新技术光电仪器[3]。其主要优点有:(1)既有高的横向分辨力,又有高的轴向分辨力,同时能有效抑制杂散光,具有高的对比度。(2)能通过对物体不同深度的逐层扫描,获得物体大量断层图象,既能对物体进行层析,又能建构三维立体图象。(3)容易实现高倍率。

　　2　基本光路及成像原理

　　共焦激光扫描显微镜是采用共轭焦点技术,使点源、样品及点探测器处于彼此对应的共轭位置。为了便于像差的校正以及便于系统升级,常采用准直光路。如图1所示,由激光器输出的激光束经透镜L1、针孔1及扩束透镜L2后,成为较均匀的准直光束,经物镜L3后会聚于物体某一点,该点反射光(或透射光、或受激辐射的荧光)又经物镜后被分束镜反射到探测光路,由会聚透镜将其聚焦于针孔2,被探测器接收,并将其输入计算机进行存储。通过二维扫描,得到物体某一层面的二维断层图象,再经轴向扫描,得到大量断层图象,经计算机图象重构,合成三维立体图象。其扫描装置也由计算机进行控制。

图1　激光共焦扫描显微镜典型光路图

　　除了图1所示基本光路外,随着荧光技术、光纤技术、彩色显微技术和光栅显微技术的引入和不断完善,衍生出一系列新型的共焦显微镜。例如共焦荧光扫描显微镜是将观察物体制成荧光样本,通过探测样本受激辐射的荧光进行成像,它更容易获得高清晰度、高分辨力的三维图象;将光纤技术和共焦技术相结合研制的光纤共焦激光扫描显微镜,可以使整个系统结构紧凑、体积小、价格低、抗干扰能力强;彩色共焦光学显微镜是用红、绿、蓝三色激光作为光源,用声光偏转元件进行激光扫描,可以在电视监控器上观察到超常规光学显微镜0.3μm以下分辨力的彩色图象,又因为三色激光均为单色光,故扩大了其应用范围;此外,将光栅显微镜与共焦技术相结合而制成的共焦光栅显微镜,可以实现超分辨,其轴向分辨力可达纳米量级。