基于线扫描方式的激光共焦显微镜的研究

　　1　引　　言

　　光学显微镜是研究物质的微观领域的重要手段,尤其是在生物医学和材料科学等科学领域。但是,由于普通光学显微镜自身在成像分辨率和聚焦深度上的明显缺陷,无法实现对具有一定厚度的物体进行成像。为了克服以上缺陷,共焦激光显微镜采用与传统光学显微镜完全不同的成像技术,具有较高成像分辨率和层析成像能力,可以用于观察活体样本的深部组织。

　　共焦显微镜的概念首先是由Minsky在五十年代提出来的,直到八十年代才受到了广泛重视[1]。LCSM成像的最大特点是能够实现活体组织纳米量级的高分辨率层析成像,对于不停进行新陈代谢的活体组织,如果不能在短时间成像,细胞生命活动、毛细管脉动等带来的微小位移都会给LCSM的成像带来致命的影响,导致图像模糊、失真。因此,提高成像速度是解决以上　　矛盾的重要途径。成像速度的提高不仅可以获得高分辨率的静态结构图,还可以为观察组织的功能行为提供可视化的工具。而传统的Minsky共焦显微镜采用单点扫描方式,完成活体组织深度结构的三维扫描需要大量的时间,从而影响了成像速度。Tizimi提出了微透镜阵列共焦显微镜系统[2],避免重复的机械扫描,大大提高了扫描速度。但是这种共焦显微镜结构复杂,成本较高。本文介绍一种用柱面镜替代圆透镜,用线扫描方式替代点扫描方式的LCSM。

　　2　基于线扫描的激光共焦显微镜系统

　　2.1　激光共焦扫描显微镜的工作原理

　　共焦显微镜采用共扼焦点技术,使激光光源、被探测点和探测器处在彼此对应的共扼位置[3]。如图1所示,光源经物镜在样品表面上聚焦成衍射限制的斑点,从样品上反射回来的光再次通过物镜,到达分束镜时被部分地反射,由收集透镜将反射光聚焦在紧靠探测器前端的针孔光阑上。针孔光阑起到空间滤波的作用,有效地抑制了来自物镜焦平面之外的杂散光。如图1　　所示,在焦平面之下的光在探测器针孔的前端聚焦,因此大部分光扩散在针孔光阑的边缘,无法到达探测器。同样,从焦平面之上的光聚焦在探测器针孔之后,因此大部分光被针孔光阑的边缘所阻挡,也无法达到探测器。然而,来自焦平面上的全部光都聚焦在探测器针孔上,可以被探测器完全探测。这种能够抑制焦平面之外杂散光的特性赋予了共焦显微镜进行深度鉴别和层析成像的本领。

　　LCSM扫描过程首先控制扫描机构在(x,y)平面内进行二维扫描,获得活体组织的一个断层图像。然后沿光轴方向重复二维扫描,从而获得多个断层图像。最后,利用计算机图像处理,实现组织内部微结构的三维成像。