共焦激光扫描显微镜的研制

一、引言

共焦激光扫描显微镜(CLSM)是光学显微观察领域的重要进展。与传统光学显微观察相比，它不仅具有高的平面分辨率，而且实现高分辨率的纵深观察，并使光学显微观察数字化，便于在计算机上进行图象处理，从而在半导体工业、材料科学、生物学和医学领域有重要的应用价值。本文借鉴国外发展CLSM的经验，从我国当前国情和现实条件出发，研制出结构简单、造价较低的CLSM样机.

二、原理与关键技术

系统原理如图1所示。准直激光束经分束器BS和物镜L，在物体表面聚焦。在共焦情况下，反射光再经Ll，BS和透镜L:无阻拦地通过小孔光阑P，被光电探测器D接收。如果物点不在与小孔光阑P对应的共焦面上，则其反射光的能量只有很少一部分能通过小孔P被探测器D接收。通过(x，刃平面内的二维扫描，可得物体一层图象。通过沿光轴方向不同层的扫描，可得多个断层图象，实现物体形貌的三维信息的采集，最后通过计算机处理，得到物体的断层图象和三维图象.在CLSM中，关键技术是扫描系统、电子系统硬件与软件(用于扫描驱动、数据采集、处理和图象显示)、保证共焦成象的调节装置。

扫描方式可分为光束扫描和目标扫描「1」。本文采用目标扫描方式，即聚焦在被测物上的激光束保持不动，物体作扫描式地移动。该方法的优点是轴线平直，光路恒定，图象失真小.对物镜的轴外象差不作要求.扫描拖动来源是步进电机。通过特殊的传动设计，在保持同步扫描的条件下，隔离振动源，以消除电机对扫描平台的振动影响。这样的扫描方式和系统，使得整个CLSM结构简单、造价低，而性能又得到一定的保证。

电子系统的硬件把光电探测器接收的信号进行放大检波，并经A/D转换送入计算机进行处理。同时，计算机通过脉冲分配驱动器控制步进电机，实现物体平面扫描。计算机软件由C语言和汇编语言混合编制。汇编语言用于控制步进电机及采集、存储数据。C语言用于图象处理和显示。

保证共焦成象的调节装置有二部分。一是扫描平台的上下调节，由此实现物体的纵深扫描;二是小孔光阑位置的调整，它由三维精密调节装置完成。

三、实验结果与讨论

CLSM样机如图2所示，光源是波长为633nm的He一Ne激光，扫描间距为0.5拼m，采集象点256x256。图3是线宽为1拜m的光栅的成象结果，使用数值孔径为0.“的40倍物镜。图4是集成电路芯片共焦分层成象的结果。由于芯片样品的分辨率不高，这里使用数值孔径为0.1的4倍显微物镜。为了明显看出各层成象结果的不同，使用的相对深度差异较大。