激光扫描共聚焦显微镜技术的发展及应用

　　1　激光扫描共聚焦显微镜的基本原理和发展

      科学研究工作对更高图像分辨率的追求产生了激光扫描共聚焦显微镜。随着免疫荧光技术在生物学研究领域的广泛应用,研究人员注意到,荧光显微照片的分辨率较低,传统的荧光显微镜使用场光源,因标本邻近结构(细胞或亚细胞结构)产生的衍射光和散射光的干扰,使标本中细微结构的成像不够清晰。激光共聚焦显微镜的主要原理是利用激光扫描束通过光栅针孔形成点光源,在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描,采集点的光信号通过探测针孔到达光电倍增管(PMT),再经过信号处理,在计算机监视屏上形成图像。由于激光光源的光栅针孔和探测针孔对物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于光栅针孔和探测针孔,进行点扫描时,扫描点以外的点不会成像,经逐点扫描后才形成整个标本的光学切片(Optic section)图像(见图1)。

　　早期的激光扫描共聚焦显微镜采用的是扫描速度较快的狭缝扫描方式,由于其在平行狭缝的光轴面上无共聚焦原理,图像分辨率不高,而被淘汰。随后发展起来的是阶梯式扫描技术,它克服轴外像差,平行移动工作台来逐点扫描标本,提高了图像分辨率,但是对标本制备要求太高,也难于成为成熟的技术。现在的激光扫描共聚焦显微镜采用的是驱动式光束扫描器,具有扫描速度较快和符合共聚焦原理的特点。目前激光扫描共聚焦显微镜的光源设计和分光采集技术也有较大的改进。首先是激光器的快速发展,使得现代的激光扫描共聚焦显微镜可以根据研究需要选择不同的激光器,如Ar UV (351,364nm),HeCd(442nm),Ar(457,488,514nm),ArKr(488,568,647nm),Kr(568nm),HeNe(543nm),HeNe(633nm)等。选择激光光源时,一方面要满足研究工作对波长的需求,另一个方面要考虑到激光光源的寿命。其次是近年来对于激光束分光和荧光采集原理也有较大的突破,目前大部分激光扫描共聚焦显微镜仍采用选择性波长滤片轮进行分光和荧光采集(见图2),这样的装置完全与传统的荧光显微镜一样使用激发波长

　　滤片和吸收波长滤片来完成对不同的荧光标记进行选择性的成像。最新一代激光扫描共聚焦显微镜可以用棱镜狭缝分光的新技术,配上合适的激光源后,能够摆脱传统的波长滤片组的限制,连续和自由地选择最佳波长(见图3),这一特点对于现在和未来开发出的各种新的荧光标记物(特别是各种荧光蛋白和荧光染料)和研究动植物的自发荧光物质有很高的价值,从某种意义上,这一技术革新已使新一代激光扫描共聚焦显微镜超脱了传统的荧光显微镜系统。与此同时用于激光扫描共聚焦显微镜的物镜也做了较大的改进,不但具有平场复消色差特性,而且能与高速扫描功能相匹配