MassPREP^TM全自动酶切仪及在蛋白质组学研究中的应用

　　蛋白质组学是继基因组学后生命科学领域中最具有前景的新兴学科,包括样品制备、双向电泳、图像扫描分析、蛋白质点切取、胶内酶切和提取肽混合物、质谱分析和数据库检索等一系列技术。其中胶内酶切和提取肽混合物是决定肽质量指纹图谱好坏的关键技术之一,国内一直采用手工方法进行胶内酶切和肽段的提取,由于程序繁琐,时间较长(约2天),样品很容易在操作过程中受到外界污染(如角蛋白等),无法满足现在蛋白质组学高通量、高灵敏度、高重现性的要求。作者所在实验室最新引进MassPREP自动酶切仪,不仅操作简便、时间短(8~10h)、降低了污染、大大节约了劳动力等,而且灵敏度高(MassPREP提取500 fmol BSA样品的20%,MALDI-TOf-MS就能够得到鉴定)、结果准确可靠。

　　本文介绍了MassPREPTM自动酶切仪的结构和功能,并将标准蛋白和肺鳞癌组织样品的一维和二维电泳上的蛋白斑点切割后做自动酶切介绍了其在蛋白质组学研究中的应用。

　　1　结构与功能

　　MassPREPTMSTATION是由Micromass公司在Packard公司生产的全自动液体处理系统基础上开发的全自动工作台[1],用于胶内蛋白质脱色、还原、烷基化、酶解和提取肽混合物及自动点靶。其标准配置由带四支Tip arm的全自动机械臂、注射泵和蠕动泵构成的泵系统、实验平台、自动加热器、循环冷却装置以及带有液位传感器蓄水装置、WinPREP软件组成。其中全自动机械臂可带动四支Tip arm进行三维方向运动实现加液、移液、点靶等多种功能;泵系统包括四个注射泵和一个蠕动泵,仪器可精确控制其吸液和排液量,保证实验具有较高的稳定性和重复性;实验平台用于摆放各种试剂盒、样品盒、靶板等实验所需耗材,实验中要求加热和冷却的部分由自动加热器和循环冷却装置完成;蓄水桶中带有液位传感器用于当桶中水量过低时发出警报终止实验,整个实验过程由Win-PREP软件全自动控制。程序如图1所示:

　　2　实际应用

　　2·1　试剂与材料

　　二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺、碳酸氢胺、α-氰基-4-羟基肉桂酸购自Sigma公司,胰蛋白酶购自Roch公司,牛血清白蛋白标准蛋白(BSA)购自AmershamPhar-macia Biotech公司,肺鳞癌组织提取的蛋白样品来自清华大学,甲酸为分析醇,乙睛为色谱醇,20μL,200μLTip,96孔板购自Packard公司,96孔靶板购自Micro-mass公司,水为除去气泡的超纯水。

　　2·2　仪器和软件

　　Spot cutter仪购自Bio-Rad公司、自动酶切操作程序为WinPREP软件控制、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)购自Bruker公司。

　　2·3　实验步骤

　　1)用牛血清白蛋白(BSA)做一维电泳得1D电泳图(见图1)[2],用Spot cutter仪取1-D电泳胶上的BSA胶带1mm2大小,放于MassPREPTMSTATION上,进行自动酶切及自动点靶。将酶切后提取得到的肽混合物用MALDI-TOF-MS测定肽质量指纹图,并进行数据库检索[3]。