实验性心肌损伤时心肌G-6-PD酶电镜研究

　　大剂量异丙肾上腺素(ISP)可引起大鼠心肌组织发生梗塞样的损伤,其心电图、能量代谢及组织病理学(包括细胞超微结构)的变化与动脉粥样硬化大鼠和人类的急性心肌梗塞非常相似。有文献报道[1],ISP致大鼠心肌损伤时,心肌组织的葡萄糖磷酸戊糖代谢途径有关酶的活性发生明显改变,本文应用电镜酶细胞化学方法观察了大鼠心肌细胞损伤过程中细胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucos-6-phosphate dehydrogenase G6PD)活性的变化。

　　材料和方法

　　1.主要试剂　ISP(sigma),葡萄糖-6-磷酸单钠盐,氯化亚铈,Maleic Acid。

　　2.实验动物及实验方法　SD大鼠,雌性,体重180～220克,随机分为三组,(1)ISP 40mg/kg组;(2)ISP 80mg/kg组;(3)生理盐水对照组。于皮下注射后4、12、24、48h取小块心尖部心肌组织,立即于2%多聚甲醛—0.2%戊二醛中轻固定0.5h。7%琼脂包埋、切片,切片用8%蔗糖,0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液漂洗3次,入去底物孵育液37℃预孵育60min,孵育液孵育60min。阴性对照:以去底物孵育液代替孵育液,1.5%亚铁氰化钾-1%锇酸后固定,常规包埋、超薄切片,铀-铅淡染,JEM-100S透射电镜观察。

　　3.孵育液配制　80mmol/L Tris-maleate(pH 6.5)缓冲液100ml中含葡萄糖-6-磷酸单钠盐60.8mg,CeCl274.5mg,蔗糖5g。

　　实验结果　对照组心肌:电镜下可见G6PD酶反应产物主要定位于细胞的胞质内,多位于细胞器之间,呈高电子密度颗粒状或线状沉积(图1)。40mg/kg ISP致损伤组:皮下注射4h,见G6PD反应标记物较对照组明显增强,表现为数量增多、颗粒增大,细胞超微结构完好(图2)。皮下注射12h,G6PD酶反应呈强阳性,见粗颗粒或块状的酶反应产物位于胞浆内尤其是线粒体周围;皮下注射24h,G6PD酶反应强度减弱,部分区域心肌细胞线粒体内出现高电子密度的絮状物,线粒体肿胀(图3);皮下注射48h,心肌组织出现明显的坏死,变性区域,G6PD反应明显减弱,细胞线粒体肿胀,嵴稀疏、断裂,甚至出现空泡化、而相对完好的心肌细胞G6PD反应也明显减弱(图4);80mg/kg ISP组,皮下注射4h即可见G6PD酶反应呈强

阳性(图5),12h部分心肌细胞线粒体可出现絮状致密物并发生肿胀、变性,酶反应减弱,48h见心肌细胞线粒体高度肿胀、破坏,呈网孔状,酶反应明显减弱(图6)。在肿胀、变性的线粒体内也可有酶反应产物的出现。

　　讨论　葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)是细胞内葡萄糖磷酸戊糖代谢途径(PPP)的关键酶和限速酶,对维持细胞的正常生理功能具有重要的意义[2]。K.S.Dhalla等[3]认为大剂量的ISP一方面影响心肌细胞膜及肌浆网对钙离子的转运,导致细胞内钙离子过荷;另一方面也引起线粒体钙离子的增加。H.G.Zimmer等早先和最近的研究[4,5]表明ISP可诱导心肌细胞G6PD酶活性及mRNA的表达。本实验证实了心肌细胞G6PD酶在ISP作用早期即可引起G6PD酶活性的明显增强,细胞超微结构无明显改变。随着作用时间增加,G6PD酶活性逐渐减弱,心肌细胞线粒体出现絮状电子致密物,线粒体肿胀、嵴断裂,甚至引起多灶性坏死。已知自由基过量产生是ISP损伤心肌的重要机制之一[1],ISP注射早期心肌细胞内G6PD活性的显著增加看来是机体的一种重要的抗损伤反应。随着ISP作用时间的增加或剂量的加大,心肌细胞内钙离子过荷、代谢产物的积聚、细胞内pH的下降,这些都会引起细胞内G6PD酶活性的下降并导致细胞器的损伤,最终可致使心肌细胞发生坏死。本实验提示,如何保持心肌细胞内G6PD的活性从而达到减少心肌损伤的目的,这是一个新的抗心肌损伤的研究方向。