纳米操纵辅助的原子力显微镜原位定位观察

　　原子力显微镜自诞生以来[1],因其独特的力学相互作用的成像原理和高分辨率而广泛应用于表面(包括气体和液体中的固体表面)现象的研究中。对动态的研究常常会涉及到AFM的原位定位成像观察。例如在单分子相互作用过程研究[2]、晶体生长方式观察[3]、可降解材料的生物活性评价[4]、表面膜的稳定性检测[5]中,都要求能对样品进行原位成像观察。但是由于扫描管自身的漂移,样品的表面状态改变等原因,不同时间得到的AFM图像的成像位置并不完全一致。因此如样品表面没有特征结构作为标记,则无法对图像进行定位,也无从判断成像是否为原位。

　　本文为实现溶液环境改变前后,HOPG表面上蛋白质吸附状态的原位观察,采用了“扫开”部分蛋白质的办法,露出HOPG表面的原子台阶作为标记,对吸附膜的结构进行了精确的原子力显微镜定位。

　　在蛋白质吸附膜的原位定位观察中,接触模式的AFM可以破坏表面结构以实现观察定位,但对样品形貌损伤较大,无法进行连续成像;轻敲模式AFM虽对表面的损坏较小,可是实现连续成像,但无法暴露HOPG表面标记,实现表面定位。研究中结合两种扫描模式的优势,采用接触模式AFM破坏部分表面结构,即“扫开”部分蛋白质,裸露HOPG部分区域用于定位,采用轻敲模式进行连续成像观察,实现了精确的原子力显微镜原位定位观察。

　　1　材料与方法

　　研究使用的原子力显微镜( atomic forcemicroscope,AFM)是NanoScope IIIa SPM系统(DI,Veeco,美国),配备O-圈和液槽。“E”扫描头;弹性系数为0·58N/m左右的普通NPS针尖。高序热解石墨(highly ordered pyrolytic graphite,HOPG)(ZYH级)购自NT-MDT公司(俄罗斯莫斯科)。

　　水是Millipore(Cat. No. QTUM 0001X)超纯水。牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)购自华美公司(SABC,上海),并稀释至10μg/ml。

　　在实验中,采用醇水替换的方法[6]在HOPG表面形成纳米气泡,轻敲模式扫描成像。然后再将BSA溶液4ml注入液槽,稳定后注入纯水4ml冲洗,再稳定10min后进行轻敲模式扫描成像。继续向液槽中缓缓注入无水乙醇2ml,速度为1ml/min,稳定10min后再进行轻敲模式成像。

　　为观察到不同阶段纳米气泡和蛋白质吸附状态的变化,要求所有图像均在原位实现。

　　在HOPG表面吸附蛋白质后再注入乙醇,吸附的BSA层会将HOPG上的原子台阶掩盖,无法进行定位。为精确标记成像的位置,注入乙醇稳定后,在轻敲模式成像前,先采用接触模式成像,将部分区域的BSA扫开,露出HOPG表面作为标识。

　　具体实验方法为,将成像模式切换到接触模式,对HOPG表面上的BSA膜进行成像,先设置较小的设置点(setpoint),和较小的扫描范围,如100nm;为避免图像中央出现裸露的HOPG表面,通过改变偏置值(offset)将“清扫”区域移到预定成像区域的边缘;改变扫描范围至需要的大小,如3μm~5μm ,此值即为“清扫”区域的宽度,“清扫”区域的高度由扫描时间,扫描速率,和扫描线数决定;待“清扫”区域足够宽(0·5μm~1μm)以后退针;切换到轻敲模式进行观察成像。