有效UPLC的实现

　　高效液相色谱(HPLC)科学已经发展了很多年，我们见证了HPLC在化学和仪器方面的许多变革。随着色谱柱颗粒直径逐渐由10 μm、5μm降低到3.5μm以及色谱柱柱尺寸的减小，分析分辨率得到提高，分析时间也得以缩短。然而，随着前几年直径小于2μm填料的推出，HPLC的前景真正地得到了改变。这种料不仅提高了分辨率，同时提供了非常有效的线性速率范围(流速/柱直径)，并显著地改进了分析速率。本文用图1所示的众所周知的van Deemter曲线解释了这一现象。1956年，Jan Josef van Deemter通过线性速率论证了填料粒径和柱效之间的关系，并由此确定最高分辨率所对应的最佳流速。根据这一假定，柱效与粒径大小成反比。图1显示了每种HPLC填料的最佳线性速率。对于粒径为1.7μm的填料颗粒，其流速的“最佳点”明显地延长。这正是很多实验室采用这一技术的原因。这意味着经几何尺寸缩放后，HPLC到超高效LC或者说UPLC (Waters Corp., Milford, MA)的发展使得色谱可在线性速率(流速)增加到2倍甚至3倍时做到分辨率几乎不受影响。分辨率、分析速度和灵敏度(较小的柱容量使得样品不用大量稀释)等多方面的改进，提高了分析通量，节省了样品和溶剂(见图2)。

   　在提高流速的同时，为了有效地发挥细柱内小粒径填料的作用，整个系统要求高压、较小的死体积和分散度。本文阐述了由一个溶剂传送系统(泵)、一个样品处理系统(进样器)以及一个专门为UPLC设计的检测器所组成的系统的性能，以及它们对粒径小于2 μ性能的影响。

　　这里，最为重要的一个问题是，系统当中无论是由色谱柱还是仪器本身产生的任何柱效损失，都会极大地影响分辨率。基于上述原因，Waters公司为使用粒径小于2 μm填料柱的系统采用整体分析策略，形成了如今的液相色谱(LC)仪器工业。这一策略始于为内径(i.d.s)在1.0~2.1 mm之间的小容量色谱柱设计小粒径填料。这种规格内径的柱子具有较小的背压，其热效应也更容易控制。与线性速率匹配的流速相对较低，但整个系统的容量相对经典HPLC系统来讲显著减小。最后，也是最困难的，就是必须使分散效应或者由仪器操作和设计导致的分离损失降到最低。系统中柱外因素对分散度的影响会抵消小粒径填料所带来的优良的分离效果。这一影响可以通过频带扩展这一传统方法进行测定。

　　第一个需要考虑的设计问题是柱管的质量是否可以耐受UPLC的运行条件。为了减少对UPLC分辨率的影响，柱外效应需要降到最低。仪器模块组装时要缩小部件间的距离，缩小系统体积，使流路的死体积更小。(注：UPLC柱管通常需要按规格进行裁切，绝不可以进行手动切割。事实上，Waters公司将柱管的端部打磨光滑，并在将其上架之前充分清洗以清除一切可能的污染物。UPLC灵敏度非常高，微量的污染物都能被其检测出来。)