基于微透镜阵列和振镜扫描的光谱分辨多焦点多光子显微技术

　　1　引　　言

　　多光子激发荧光显微技术利用近红外激光(700~1000 nm)对样品进行非线性激发,不需要共焦针孔即可获得样品的三维图像。与采用蓝紫光的单光子激发荧光显微技术相比,多光子激发减少了激发光的散射,提高了成像深度,有效减小了光漂白和光损伤,可以对生物样品进行实时在体监测,是目前广泛应用的激光扫描共焦显微技术的重要补充[1~8]。为提高成像速度和光能利用率,发展了基于声光扫描技术的双光子激发显微技术[9,10]、线扫描双光子激发显微技术[11,12]和多焦点多光子显微(MMM)技术[13]。

　　线扫描双光子激发显微技术的激发效率低,需要提供更高功率的激发光,更重要的是,由于采用线激发,各光点间彼此干扰,导致空间分辨率低。MMM技术的空间分辨率类似于单光束的双光子激发荧光显微技术,但由于采用多路并行激发,显著提高了光能利用率以及成像速度。在阵列点间距大于7λ(λ为激发光波长)时,阵列点间不存在激发光的串扰,而且阵列点数越多成像速度越快,成像速度可达到视频级,是研究细胞和组织等的重要工具[14~16]。

　　然而,目前所报道的MMM技术仅能对荧光强度成像。我们前期报道了一种具有同时时间和光谱分辨功能的MMM(STSR-MMM)技术[17],但要获得样品二维或三维空间的光谱和寿命信息,必须用阵列点对样品进行步进扫描,成像速度慢。而实际上,在许多应用场合,如多色标记测量[18]、荧光共振能量转移(FRET)[19]和荧光比率成像[20]等,仅需要快速获取样品的光谱信息。针对这种情况,本文提出并研究了一种光谱分辨多焦点多光子显微(SR-MMM)技术,利用微透镜阵列将样品分成多个子区域,采用棱镜对样品所发出的荧光进行光谱色散,结合二维振镜特殊的扫描模式,实现样品的并行多线激发。

　　2　实验装置

　　光谱分辨多焦点多光子显微系统的工作原理如图1所示,该系统主要由钛宝石锁模飞秒激光器(Coherent, Mira 900F)、倒置荧光显微镜(Nikon,TE2000U)、分光棱镜(材料K9玻璃,顶角60°)、微透镜阵列(SUSS MicroOptics)、CCD相机(PI,Coolsnap EZ)和计算机等组成。飞秒

激光器输出光脉冲的重复频率为76 MHz,功率约800 mW。微透镜阵列的大小为10 mm×10 mm,子透镜直径为1.03 mm,焦距24 mm。飞秒激光脉冲经扩束和整形后,照射到微透镜阵列上,形成多路子光束,在微透镜像方焦平面束腰处,也就是图1中虚线所示位置的大小约为4μm。经光学耦合系统和倒置显微镜在样品上形成4×4的紧聚焦点阵,用于样品的双光子激发。每个阵列点的光功率约为5 mW。光学耦合系统将微透镜产生的点阵成像到样品上,通过改变耦合系统的参数可以改变阵列点数以及激发点之间的距离。