非共轴激光共焦显微技术的研究现状与展望

　　1　引　　言

　　提高分辨力一直是激光共焦显微技术研究领域的永恒课题。由于衍射现象的限制,依靠增大物镜的数值孔径(NA)和减小光源波长提高分辨力的方法局限性很大,远不能满足日益增长的高精密成像和测量对分辨力的要求。此外,随着航天技术、空间生物技术等领域的发展,对仪器的小型化要求也日趋迫切。针对于此,国内外学者做了许多努力[1~9]。近年来发展起来的非共轴激光共焦显微技术首次通过改进共焦显微技术的光路结构达到了提高轴向分辨力的目的,且具有大工作距离、大视场和易于小型化等优势。目前,非共轴激光共焦显微技术主要包含共焦theta显微技术和双轴共焦显微技术两个典型的研究方向,国外大多还处于原理性研究阶段[10~18],仅小部分进入仪器化研究阶段[19~31],且主要应用方向集中在生物医学领域,而国内的相关研究尚未起步。无论是从提高轴向分辨力、增大工作距离的角度出发还是从易于小型化的角度考虑,非共轴激光共焦显微技术都能很好地满足现有高精密成像与测量对仪器的要求,具有良好的发展潜力。

　　本文介绍了非共轴激光共焦显微技术的研究现状,并展望其未来的发展趋势。

　　2　基本原理

　　非共轴激光共焦显微技术的基本原理[10,11]是将共焦显微系统中被测样品与照明光轴成一定角度放置,使得照明光轴与采集光轴形成一定的夹角,如图1所示。由于激光共焦显微系统的点扩散函数(PSF)是照明PSF与采集PSF的乘积,因此当两个光轴不共轴时,两个点扩散函数会相互制约,重叠部分明显减小,使得系统的合成焦体体积减小。焦体越小,显微系统就能观察被测样品的更精细结构的信息,从而达到提高共焦系统轴向分辨力的目的[10]。理论上当两个光轴正交时,系统的合成焦体体积最小,可形成一个近乎球形的焦体。

　　3　研究现状

　　3.1　共焦theta显微技术

　　1994年,E. H. K. Stelzer等[10,12]提出了一种新的共焦theta显微技术,将照明光轴和采集光轴正交放置,首次对激光共焦显微技术在光路结构上进行了改进。该技术使得系统的PSF在轴向和横向上的尺寸变成相近,但牺牲了横向分辨力。比如,物镜NA=0.94的共焦theta双光子荧光显微镜的焦体体积为51×106nm3,轴向分辨力为230 nm,x方向的横向分辨力为290 nm。与同等条件下的共焦荧光显微镜相比,该技术的焦体体积缩小至原体积的45%,轴向分辨力提高了3.5倍,横向分辨力降低了53%。通过对包括传统显微镜、共焦显微镜、4Pi共焦显微镜和共焦theta显微镜在内的各种显微镜的轴向分辨力和焦体体积进行比较[10],发现共焦theta显微系统对轴向分辨力的提高程度最大。