激光扫描共聚焦显微镜中云纹法的实验研究

　　0　引言

　　自从1948年Weller和Shepard[1]提出几何云纹法以来,至今云纹方法已经发展成实验力学中的一种成熟有效的变形观察、测量手段[2-4].在过去的几十年中,得益于各种新的实验技术的引入、光栅制作工艺的不断改进以及各种高分辨率电镜的出现,云纹方法至少出现了两个令人瞩目的重要进展.其中之一是80年代初Post[4]等提出和发展的云纹干涉法,现在云纹干涉法已被认同为是光测力学中几种最常用的变形观测手段之一,在宏、细观力学的变形分析中都得到广泛的应用.云纹法的另一个重要进展以Dally和Read发展的扫描电镜云纹法(或电子束云纹法)[5-6]为代表.从云纹条纹形成的原理来看,扫描电镜云纹法与传统的几何云纹法相类似,两者最主要的区别在于:1)传统的几何云纹法使用的光栅频率低于100线,而扫描电镜云纹法使用的光栅频率最高可达10 000线,因此测量的灵敏度得到极大的提高;2)扫描电镜云纹法中无需制作参考栅,扫描电镜的扫描线代替了几何云纹法中的参考栅线形成云纹条纹.相类似的原理可以用来解释其它高分辨率电镜云纹法[7-11](如原子力电镜(AFM)云纹法、扫描隧道显微镜(STM)云纹法等).这些高分辨率电镜云纹法为实验力学提供了微米至纳米量级的分辨率,并被成功地应用于微、纳观尺度下物体表面变形的观察和测量.

　　尽管云纹干涉法和扫描电镜云纹法可用作微米尺度下变形观测的一种有效手段,但这两种方法仍有不足之处.比如:云纹干涉法需要较复杂的光学干涉系统,且对测量环境和隔振条件要求严格;而扫描电镜云纹法只能在真空环境中进行测量,由于扫描电子显微镜的真空室尺寸有限,这便对待测试样的形状尺寸提出要求.此外扫描电镜云纹法还要求待测试样表层必须导电,以防止电子束对试样表面造成破坏并污染电子枪.这些例外的限制无疑增加了测量过程的复杂性.因此发展一种操作简便、适用广泛的微米尺度云纹法不仅仅是实验方法的拓展,而且对于实验力学的研究人员来说更是有实际意义.

　　20世纪80年代发展起来的激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscopy,LSCM)是当今生物学研究领域中的一种先进的图像采集和分析仪器[13].LSCM利用激光作为照明光源,在传统的光学显微镜的基础上采用了共轭聚焦的原理和扫描成像装置.与传统的光学显微镜相比它不仅能够提供更高的空间分辨率(水平方向的分辨率可达到0.2μm),并能够提供更高质量的试样图片,且对工作环境无特殊要求.LSCM的这些优点自然吸引本文作者将其与云纹法相结合,以确立另一种新的用于微米尺度变形测量的云纹法.

　　本文基于LSCM的扫描成像原理,阐述了一类新的云纹法———LSCM云纹法.在LSCM云纹法中和试件栅干涉形成云纹条纹的参考栅为具有亚微米分辨率的LSCM扫描线.实验中,通过调整LSCM的扫描范围,可使试件栅和参考栅的频率相匹配,从而形成LSCM云纹.通过实验研究了LSCM扫描线与1 200 lines/mm的全息光栅相干涉形成的平行云纹和转角云纹,成功地证实了LSCM云纹法作为一种高准确度微米云纹方法的可行性和真实性.