界面折射率不一致对显微成像穿透深度的限制

　　0　引言

　　共焦显微术与多光子显微成像术等先进显微成像技术的理论研究与产品开发方面的巨大进展,使得生物医学工作者非侵入式地研究生物组织内部结构和功能成为可能.因为这些新的成像技术非侵入式地对样品内部实现光学断层成像,并进而借助于计算机合成被研究样品的三维图象[1~8].我们知道,不可能设计一个对物空间所有点都成完善象的光学系统.因此,在传统的显微镜的设计中,使其满足正弦条件,以便它可以在一对固定的共轭面之间成高质量的图象.这样,为了对位于一定深度的物体进行成像,就必须将其移到所设计的物面上.否则,将引入球差,因为破坏了赫希尔条件.同样,由于在共焦显微术与多光子显微成像术中,也采用普通的显微物镜,当对位于样品表面下的生物结构成断层图象时,样品必定位于显微物镜的设计物面以外,而生物组织的折射率与外部介质如空气、浸液及盖玻璃等也不同,因而会引入球差等.由此可见,为了能最有效地利用这种成像技术,即为了正确的解释所获得的图象与生物组织的结构和功能之间的关系,以及为了评价和优化所设计的系统,就有必要分析由于界面折射率不一致对显微成像穿透深度以及焦点区域光分布的影响等.

　　Sheppard等研究了由于界面折射率不一致对共焦显微成像质量的影响[1],Smithpeter等则运用信噪比及信号背景比分析的方法研究了共焦显微成像的穿透深度极限[2].本文提出一种分析由于界面折射率不一致而产生的对显微成像深度的影响的方法,并将所得的结果与用信号背景比所得的结果进行了比较.利用所得的结果,还可以分析界面折射率不一致对焦面附近光场分布的影响等.

　　1　基本理论

　　如图1所示为显微成像时光束会聚的简图.一束平行光入射到物镜上.由物镜出射的光束经过浸液介质(小数值孔径时为空气)及盖玻璃后会聚到生物组织等的样品内一点.由于生物组织内部组织折射率不均匀而后向散射的光,或者由样品中激发出来的荧光再经过物镜会聚后供目镜观察或者用光电倍增管等探测器在像面上探测.显然,为了获得高质量的显微图像,显微物镜在样品中的聚焦点必须有足够好的能量分布,如衍射斑必须足够小,以便只探测来自一个极小区域的信号.然而,生物组织的折射率为n3=1.38~1.41,盖玻璃的折射率n2=1.516,空气的折射率为n1=1等.对于大数值孔径的高倍显微镜,一般用阿贝型油浸物镜来实现,常用的浸液是杉林油,其折射率n1=1.515.这种折射率的不一致会使由物镜出射的光束发出畸变·因此为了获得高质量的图像,有必要对这畸变的大小进行计算,从而分析其对光束穿透深度等的影响.