二维扫描共焦显微镜的研究

　　1　引　言

　　共焦显微镜可以实现光学切片,即把照明光束聚焦到有一定厚度的透明或者半透明样本内部的某个层面,只接收样本焦面的反射(散射)光束,而将非焦面的反射(散射)光束遮挡掉,通过改变照明光束在样本中的聚焦深度获得样本的各个层面的图像,实现对样本无损成像,并且具有高分辨力和强对比度。目前国内外主要采用:(1)二维扫描振镜式[1],利用两个互相垂直的平面扫描振镜实现光学切片二维成像;(2)Nipkow盘扫描[2],通过旋转Nipkow盘(20000个针孔按精密的螺旋线依次排列在基盘上)实现二维扫描。

　　在成像过程中,照明激光通过旋转的Nipkow盘依次通过各个针孔,聚焦到生物样本焦面;在样本焦面的相应位置上激发出来的荧光信号按照原光路返回进入探测光路并被记录。这种方式光能利用率只有1%,引起系统能量的极大浪费。(3)微透镜阵列[3,4],这种类型共焦显微镜是通过微透镜阵列,实现光学切片二维成像。

　　2　仪器的基本原理

　　自行设计的激光共焦扫描显微仪器主要由几大模块组成,包括:光学成像模块、光电转换模块、机械扫描模块、计算机控制、数据处理模块,整个系统结构如图1所示。

　　2.1　光学成像模块

　　激光共焦扫描显微系统的光学成像模块主要包括:传统显微镜和中间光学系统。光学模块原理如图2所示:Ar+激光器输出的波长为488nm的激光通过扩束镜、滤波针孔和扩束镜后,被调整成为光学强度分布均匀的平行激光束,由半透半反镜、平面反射镜反射到显微镜中,通过显微镜目镜、物镜聚焦到焦面的扫描样本中;扫描样本的信号按原路返回,通过显微镜的物镜、目镜、平面反射镜和半透半反镜,到达探测光路,被探测物镜聚焦到探测针孔上,由光电倍增管PMT接收。

　　2.2　机械扫描模块

　　激光共焦扫描显微镜系统进行三维立体成像的过程是:首先对实验样本焦面进行二维扫描成像;然后,在沿轴Z方向上,利用Z轴扫描定量改变实验样本的位置,即改变实验样本焦面位置,并且对此新的焦面位置二维扫描成像,实现实验样本的光学层切,记录各个位置的样本层切像;最后通过计算机处理数据,对样本成三维立体像。所以为了对样本实现三维立体成像,激光共焦扫描显微系统必须具备平面扫描系统、轴向扫描系统。在本扫描共焦显微镜系统中选用的是结构简单、扫描精度极高的美国CambridgeTechnology公司的6810P型的二维扫描振镜,实现显微成像X、Y方向的二维扫描。旋转轴分别平行于X、Y方向的两个平面镜,依次以一定频率作周期振动,使入射照明光束进入显微物镜的角度有规律的改变,从而使得照明光束经过显微物镜后的会聚光斑,在样本成像切面进行X、Y方向的二维面扫描。