荧光与荧光显微镜

　　1　荧　光

　　当某种物质(P)受到波长较短的光波照射时,会发射出波长较长的光[图1(a)]。若切断照射光后仍能发光,称之为磷光[图1(b)];若照射停止后光立即熄灭,这种光称之为荧光[图1(c)]。

HL—高强度光源; EF—激发光滤色片; P—试样。

图1　磷光和荧光发生图

　　荧光发光机理可按量子理论通俗解释:光具有波动、粒子二重性,光波愈短,其光子能量愈强;反之波长愈长其能量则弱。当某些物质受到紫外线或较短波长光照射,吸收了全部或部分光能量,使其分子的能级升高而处于亚稳定状态,当恢复到稳定的基态时,这些分子就会立即释放多余的能量,其中一部分化为热量而消失。但对某些物质而言,向基态跃迁时是以“光”形式释放,因为有部分能量被消耗,所以重新发出的光能量总比吸收的能量要小。由于能量愈小,光波愈长,所以物质所激发的荧光总比照射它的光波要长。磷光的能量较荧光还要小,所以它的波长比荧光要长,寿命可达数小时之久,这就是两者的区别。激发物质发出荧光的照射光称之为激发光,也是该物质吸收光,它的光谱包含紫外线、蓝光,现已扩展到黄绿光波段。

　　荧光光谱色随物质的差别和所用荧光色素的不同也有区别。它的光谱与可见光一样,红、橙、黄、绿、青、蓝、紫全有,有的物质标本只有一种颜色荧光,但有的有多种颜色荧光。荧光可分为自然荧光和人工荧光两种:

　　自然荧光(或称一次荧光、自发荧光、自体荧光和原发荧光):某些物质勿需经过处理,当受到激发光照射就能产生荧光的称为自然荧光。如植物的叶子、茎;动物的一些组织:牙齿、骨质、爪甲、白头发、尿液、血浆及维生素等;某些结晶体、有机化合物、合成物、油类、蛋白质、腊等。所以自然荧光在造纸、纤维、染料、化学药品、食品和油脂等工业方面被用作检查和鉴别。在环保中对大气污染公害的监测中也用紫外线进行粉尘荧光观测。

　　荧光显微镜初期就用于观察动、植物标本的自然荧光。

　　人工荧光(或称二次荧光、继发荧光、染色荧光):某些物质必须经过化学处理,如用染料——荧光色素——与其结合,才能在激发光下发射荧光。所谓荧光色素是一类能产生明显荧光,并能作为染料使用的有机化合物,它有天然和人工合成两类,后者常用的有数十种之多,如吖啶橙、罗达明等。荧光色素也叫作荧光染料,这样非荧光试样通过有选择的荧光色素进行染色后,在荧光显微镜下就可从颜色和反差中清晰地分辨其中不同的细胞组织。染色荧光方法在细胞化学和组织化学中很早就应用了,如用盐基黄(Auramine)对结核菌染色是常见的。