荧光显微镜及放射自显影观察147Pm内照射诱发免疫细胞凋亡

    考虑到细胞凋亡是细胞的一种主动生理过程,它严格地控制着正常细胞的死亡和增殖平衡,在组织细胞更新和细胞发育,以及维持机体内环境的稳定方面起着重要作用。已经观察到γ射线和X射线外照射可导致细胞凋亡发生^[1]。但有关放射性核素内照射诱发细胞凋亡的研究,文献中未见报道。而作为荧光涂料的激发能源和在核辅助动力装置系统中广泛应用的β辐射体核素147Pm[2]对人类和生态环境的污染已引起人们的关注[3]。为此,我们研究了该裂变产物核素147Pm内照射诱发人T淋巴细胞白血病细胞株Molt-4细胞以及巨噬细胞株ANA-1细胞的凋亡作用。从而可对临床上受放射性核素147Pm内污染病例的免疫功能评估和预后提供依据。

    1　实验方法

    1.1　细胞培养

   实验用免疫细胞为急性T淋巴细胞白血病细胞株Molt-4细胞和巨噬细胞株ANA-1细胞,来源于上海细胞研究所,由我院细胞免疫中心室传代培养。实验所用上述免疫细胞株用RPMI-1640(GIBCO)全培养液中维持培养,即在RPMI-1640培养液中增补10%灭活小牛血清,2mmol/L谷氨酰胺,100U/ml青霉素,100mg/L链霉素。用NaHCO₃调pH至7.2使用^[4]。实验时,取对数生长期Molt-4细胞,先用Hank′s液洗涤两次后,再用全培养液调至实验所需细胞浓度备用。ANA-1细胞则先用0.25%无菌胰蛋白酶消化,随即用Hank′s液洗涤三次去除胰蛋白酶后,用全培养液调至所需细胞浓度备用。

    1.2　细胞受¹⁴⁷Pm内照射的累积吸收剂量估算

    收集实验用的Molt-4和ANA-1细胞,用RPMI-1640全培养液调至浓度为2×10^6/ml。取无菌24孔培养板,在每培养孔内放置1ml细胞悬液。然后在每一实验孔中另加入1ml用RPMI-1640全培养液稀释的7.4×10²MBq/L₁₄₇　Pm工作液,从而使₁₄₇Pm的最终放射性活度为370MBq/L。而对照组每孔加入1ml RPMI-1640全培养液,使实验孔和对照孔细胞最终浓度为1×106/ml。将24孔培养板放置到5% CO2培养器内37℃培养,在不同时间收集细胞用于细胞凋亡研究。实验中选择的时间观察点为3、6、9、12、24、48h。对Molt-4或ANA-1细胞受147Pm内照射不同阶段的累积吸收剂量D的估算,参照下列公式进行[5]

    D=AE/m

式中,A为147Pm内照射的放射性活度,E为147Pm的β粒子平均能量,m为受照细胞质量。

    1.3　荧光显微镜细胞核形态观察

    收集受荧光涂料激发能源147Pm内照射作用不同时间的Molt-4和ANA-1细胞,用无Ca++、无Mg++的Hank′s液洗涤。随后将上述两株免疫细胞分别用RPMI-1640全培养液悬浮调至2×10⁶/ml的细胞浓度,在24孔培养板的每培养孔内放入1ml细胞悬液,再在实验孔中另加入1ml用RPMI-1640稀释的147Pm工作液,使最终的放射性活度达370MBq/L。而对照组每孔则加入1ml RPMI-1640全培养液。然后放置到5% CO₂培养器内37℃培养。经不同时间(3、6、9、12、24、48h)收集¹⁴⁷ Pm内照射作用后的Molt-4及ANA-1细胞,用无Ca++、无Mg++的Hank′s液洗涤5次,去除游离的¹⁴⁷Pm,再将细胞用200g离心10min后,悬浮于1.5ml含有50g/L的碘化吡啶、0.1%乙酸钠和0.1%的Triton X-100的低渗荧光溶液内^[6],避光放置于4℃条件下,用于荧光显微镜观察着色的细胞核形态。