光学显微三维成像特性的实验研究

　　光学显微三维成像技术是一项集光、机、电、计算机及图像处理于一体的新兴技术[1~4].与传统的光学显微镜相比,该技术的优点是:a.可对试样内部直接成像,避免机械切片及由此对试样造成的损伤;b.具有高的轴向分辨能力;c.可以获得厚度小于1μm的超薄光学切片;d.可以成高分辨率的二维层析图像;e.用计算机对数字图像进行分析和处理,可以重构成三维超分辨图像,再现出试样的三维微细结构.

　　此成像技术的非接触测量及三维超分辨能力,使其在生物医学、半导体器件检测、材料分析以及表面粗糙度测量中得到了广泛的应用.为保证光学显微三维成像系统具有三维超分辨率成像特性,采用了高质量的扫描成像光学系统、高精度的光电控制系统以及高性能的图像处理系统.

　　1　成像特性

　　激光共焦扫描显微镜(CSOM)的工作原理是激光束准直后由物镜聚焦成一点照明试样,对物体进行扫描,集光镜将聚焦后的扫描点成像在探测器上,由光电探测器对其进行接收并变成电信号,实现串行成像,并在显示屏上显示或存入计算机中进行处理.由于物镜和集光镜共同聚焦在试样上的某一点,因此称为共焦显微镜.由工作原理可知,CSOM将普通显微镜对面的观察转变成了对点的观察,输出也由并行方式转换成了微机处理系统所要求的串行方式[1,2].对普通光学显微系统来说,其一个点物的像面光强分布为

　　式中, V为归一化光学坐标;h1为系统的振幅点扩散函数(透射光由一个大面积的探测器接受);g2是探测器模的平方的傅里叶变换.根据瑞利极限定理,当两点的像面光强分布在中间位置处取值为极值的0.735倍时,这两点恰好能被分辨,即

这时系统的分辨极限为2Vd. Vd为归一化的探测器尺寸.

　　对于共焦成像的情况,其探测面的光场分布为物面振幅分布和点扩展函数的卷积

式中,h1是共焦透镜的点扩散函数;t是点物的复振幅透过率.

　　若物镜和集光镜均为圆瞳,且数值孔径相等(实际的反射或荧光系统,光路往返可满足上述条件),则可推得

　　与式(1)比较,其主极大半宽减小了27 %,且旁瓣强度也迅速减弱.进一步的理论分析表明,CSOM的横向分辨率可达瑞利极限的1.4倍,若使用环形透镜,其分辨率还可进一步提高.

　　由图1可以看出,照明光束离焦后,在探测平面上不能形成点像而是一个弥散斑.其大部分信息被针孔拦掉,能量很快衰减.因此只有在聚焦点处的平面经扫描后可成清晰图像,而离焦面信息对成像基本上无影响,这使得CSOM具有独特的纵向分辨率.共焦显微系统像面附近光强分布为

　　对于使用圆形光瞳的情况,两个圆孔径具有相同数值孔径,而沿光轴上的光强分布为: