基于CCD虚拟针孔探测的双轴共焦显微技术

　　0　引　言

　　双轴(DA)共焦显微技术具有独特的非共轴结构[1—4],该结构将被测样品与照明光轴成一定角度放置,则照明光轴与采集光轴形成一定的角度,从而使得照明系统和采集系统的点扩散函数(Pointspread function, PSF)相互制约,达到减小系统的合成焦体体积,提高系统轴向分辨力的目的。与传统单轴(SA)共焦显微技术相比,双轴共焦显微技术可利用较低数值孔径物镜实现较高的轴向分辨力,且具有工作距离大、信噪比高等优势。本文对基于CCD虚拟针孔(VPH)探测[5]的双轴共焦显微成像系统的空间分辨特性进行了理论分析,并构建了相应的实验系统,对其轴向响应进行了实验验证,为后续研究提供了理论基础与实验数据。

　　1　虚拟针孔(VPH)双轴共焦显微成像系统

　　1.1　双轴共焦结构

　　理想衍射受限系统三维PSF的中心亮斑可以认为是一个椭球体。如果我们令该椭球体的三个轴长分别等于共焦系统x、y和z轴方向的PSF的半高宽(FWHM)的两倍,那么该椭球体可以包含由光瞳出射的82%的亮度。定义该椭球体为焦体(focalvolume)[1],其体积决定了系统单次采样所能测量到的样品区域的大小,即决定了系统的空间分辨力。要改善系统的分辨力,实际就是减小焦体体积。

　　共焦显微系统的PSF是照明PSF与采集PSF的乘积。对于传统的单轴共焦结构,其焦体是一个z方向轴长大于x和y方向轴长的椭球体,因此单轴共焦系统的横向分辨力要比轴向分辨力高3~4倍[1]。对于双轴共焦结构,采用独立的照明物镜(IL)和采集物镜(CL)构建照明光路和采集光路,使照明光轴和采集光轴都与测量光轴z成θ角,且两个物镜的几何焦点重合,将该焦点作为系统原点,如图1所示。该结构中照明PSF和采集PSF将相互制约,使合成焦体体积明显减小、系统单次采样所能测量到的样品区域的大小更为精细,从而达到了提高共焦系统分辨力的目的。理论上,当两个光轴正交时,系统的合成焦体体积最小,可形成一个近乎球形的焦体[1]。

　　1.2　双轴结构的点扩散函数和空间分辨力

　　上述双轴结构对共焦系统空间分辨力的改善还可以通过基于旁轴近似的衍射理论来进行推导。如图1所示,系统坐标为(x, y, z),照明光路坐标为(xi, yi, zi)和采集光路坐标为(xc, yc, zc)。三个坐标系之间的转换关系可表示为[2,3]

　　设系统为均匀照明,照明光源波长为λ,对于位于空气中的反射系统(n=1),反射进入采集光路的光波波长并不发生改变。则照明PSF和采集PSF分别为[3,6]

　　式中J0是零阶贝塞尔函数;ρi、ρc分别是IL和CL的归一化径向半径;vi、ui和vc、uc分别是IL和CL的归一化光学坐标。