荧光显微镜实验的设计

0 引 言

荧光显微镜技术在光学显微镜领域占有极为重要的地位。自 1904 年库列( Kehler) 创建以紫外光为光源，激发出荧光，以观察细胞组织结构的方法以来，各国已开发出系列化的荧光显微镜产品，在医学和生物学的研究中获得了广泛的应用［1-3］。荧光显微镜因其光源波长短，具有超出传统显微镜分辨率极限的高分辨率，且能够直接显示标记微量荧光抗体等生物化学成分，在免疫学和临床诊断方面具有其他技术方法难以替代的作用［4］，在光学领域也有很高的学术研究价值［5］; 但现实中由于专业荧光显微镜价格昂贵，缺乏相应的教学实验，仪器专业的学生对此也仅有概念上的认识。为此我们以普通生物显微镜为实验平台，配置荧光附件，开发出面向研究生的荧光显微镜实验，以弥补这一缺憾。

1 实验系统原理

荧光显微镜利用紫外光或短波可见光使被检样品的原子受到激发，按 Stokes 定律，将释放波长更长的可见光即荧光，用以观察和分辨样品中某些物质及其性质［6］。

荧光显微镜有多种形式，我们采用的是落射荧光+ 透射明场的组合方式［7］，如图 1 所示。显微镜采用科勒照明，卤素灯发出的光经聚光镜汇聚照明标本 P，使用卤素灯的透射明场用于搜索定位，也可用于比较荧光与非荧光部位的细微结构。

超高压球形汞灯发出富含紫外线的强光，经激发滤色片 EF、二向色分光镜 DM 反射、通过物镜 OB 射至标本 P 上激发荧光物质; 发出的荧光再经物镜 OB，部分透过二向色分光镜 DM，此后截止滤色片 SF 可吸收激发光谱的反射光，让荧光通过。透射的荧光经分光棱镜 DP 后分为两路: 一路在分光面上反射，经过目镜供实验者观察; 另一路透射后至 CCD 摄像机光敏面成像。

2 实验设计

我们使用宁波永新光学公司生产的 NOVEL XSZ－ 107B( N) 型双目生物显微镜，配加了落射荧光附件，包括: ①光源( 内装 HBO 超高压球形汞灯) ，②落射荧光装置( 内含主机滤光系统) ，③防紫外挡板等。为记录实验现象，另配 CCD 摄像机、USB 接口的图像采集棒和笔记本电脑，图 2 为实验系统照片。

实验按照先理论、后操作，再总结的步骤安排如下:

( 1) 理论学习。荧光的激发涉及原子物理学，但标本的制作与观察属生物化学范畴，知识跨度大。我们安排学生课前看参考文献预习，请助教博士生经充分的资料调研，将荧光显微镜原理采用与学生本科阶段所学知识相衔接的数学语言加以描述; 选取具代表性的原理图和显微镜内部结构图，制成图板和 PPT 幻灯片现场讲解，让学生尽快掌握关键知识点，为后续的实验操作打好基础。