原子力显微镜在生物分子力学性质方面的研究

　　1986 年，Binnig 发明了原子力显微镜 (AFM)，Quate 和 Gerber[1] 提出对生物大分子和细胞表面成像的新方法。传统的高分辨电子显微镜要求样品导电或工作环境为真空，而 AFM 不需要这么苛刻的条件。通过固定在微悬臂上的探针与样品在接触过程中产生的相互作用，AFM 可以在任何环境下对生物大分子和细胞表面成像。除了能对样品成像，AFM还能测量生物分子内部和生物分子之间的相互作用力。这对于了解生物分子的结构和物理特性是非常有意义的。因为这种作用力决定两种分子的相互吸引或者排斥，接近或者离开，化学键的形成或者断裂，从而决定了分子的结构、动力学和功能。在分子间作用力的支配下，还同时支配着生物体内的各种生理现象、生化现象、药物药理现象，以及离子通道的开放或关闭，受体与配体的结合或去结合，酶功能的激活或抑制等等。因此，生物分子间作用力的研究，在某种意义上说，就是对生命体功能活动中最根本原理的研究。这也为人们理解生命原理，提供了一个新的研究手段和工具。

　　1 AFM 力曲线原理

　　AFM 主要由弹性微悬臂(其上有直径为纳米级的探针)、压电陶瓷扫描管、检测系统和反馈控制系统等组成，见图 1。当微悬臂固定端垂直接近，然后离开样品表面时，微悬臂和样品间产生了相对移动。而在这个过程中微悬臂自由端的探针也在接近甚至压入样品表面，然后脱离，此时原子力显微镜(AFM)测量并记录了探针所感受的力，从而得到力曲线(图 2)。Zs 是样品的移动，Zt 是微悬臂的移动。这两个移动近似于垂直于样品表面。用悬臂弹性系数 c 乘以 Zt，可以得到力 F=c·Zt。如果忽略样品和针尖弹性变形，可以通过 s=Zt-Zs 给出针尖和样品间相互作用距离 s。这样能从 Zt(Zs)曲线决定出力 - 距离关系 F-(s)。这个技术可以用来测量探针尖和样品表面间的排斥力或长程吸引力，揭示定域的化学和机械性质，像粘附力 [2,3] 和弹力 [4,5]，甚至吸附分子层的厚度 [6]。如果将探针用特定分子或基团修饰，AFM 基底连接上另一种分子，然后探针在垂直方向上不断接近和离开基底。这时，两种分子发生相互作用得到力谱曲线。利用力曲线分析技术就能够给出特异结合分子间的力或键的强度。

　　2　生物分子内部力的测量

　　研究分子内部的作用力，如蛋白质分子 [9]、DNA分子 [10,11]、多糖分子 [12] 和核糖分子 [13,14] 内部化学键的形成与断裂，有助于我们了解生物分子的结构和物理性质，以及它们立体构型的维持和改变，这对生物医学和临床医学有重要意义。

　　Claire Verbelen 等 [15] 研究了从弯曲乳酸菌种提取出来的 S- 层蛋白 CbsA 分子的力谱。当拉伸速度为 1000 nm/s，针尖作用时间为 500ms 时，CbsA 蛋白分子的力曲线上出现了多个呈锯齿形的峰，力的大小为 58±26pN。研究者认为这个力是由蛋白质分子的二级结构 α- 螺旋在探针的作用下解螺旋产生的。从 CbsA 蛋白分子的 C 端分离出来的 CbsA 1-273 多肽分子峰的大小为 83±45pN，说明 CbsA 的 C 端比较稳定。而 N 端区域的 CbsA288-410 多肽分子带正电荷，力曲线上单个峰最大为366±149pN，说产生该力的是分子间的静电作用，而不是分子的折叠力。