基于质谱的TOP-DOWN蛋白质组学技术用于微生物鉴定

　　传统技术对于微生物的检测和鉴定往往很慢(数天时间)，并且灵敏度低，特异性差。很多领域，从医学诊断到国土安全，都将得益于可进行天然以及生物工程微生物快速、可靠检测和鉴定的新型分子水平技术的发展。近期快速发展起来的质谱(MS)凭借其诸多优点已成为这样一种技术^[1,2] 。一个微生物的质谱鉴定实验，包括样品的采集和制备，整个过程不到10min。此外，质谱还是一种通用技术,它可以检测到所有类型的病原体，即病毒、植物细菌、真菌及其孢子，寄生原生动物，并且需要样品量很少，可少于104个

微生物。目前采用质谱检测和鉴定微生物主要基于质谱图中是否存在特异性的生物标记物的分子离子。因此，不同微生物具有不同的质谱图，即微生物指纹图谱(图 1^{[ 3 ]} )。

　　采用新型的质谱软电离方法，如基体辅助激光解吸电离(MALDI)和 / 或者电喷雾离子化(ESI)，可获得微生物的质谱图。当微生物经过纯化、分级、富集和色谱分离后，可将ESI与多种质量分析器相结合，进行大规模的不同微生物的蛋白质组学研究。相反，MALDI 对盐和其他杂质的耐受能力高，因此，在只对样品进行简单处理的情况下，MALDI可被用作快速检测和鉴定完整微生物的质谱传感器平台的离子源^[1] 。在 MALDI技术中，在完整的微生物(病毒、孢子、植物细菌等)中添加少量的酸性基质溶液有助于细胞裂解和生物标记物的原位提取(在 MALDI 探针上)。脉冲激光照射到固体样品/基质混合物上可产生特异性的微生物生物标记物离子。这些离子可通过飞行时间质谱(TOF MS)进行进一步的分析。

　　完整微生物的MALDI MS结果受诸多实验因素的影响，如蛋白生物标记物的提取和溶解性、由于培养时间和基质差异导致的生物标记物蛋白表达水平的多样性、不同生物标记物分子的离子化效率(和基质 / 生物标记物蛋白的比例有关)、激光脉冲能量的变化以及不同仪器间检测效率的差异。为了鉴定微生物，可将实验得到的质谱图与已被编入质谱指纹图库中的已知微生物的指纹图谱进行比对。然而，为了使该方法更加有效，必须把大量的微生物质谱数据编入指纹图库中。该方法的另一个局限性就是图库中缺乏新的、刚出现的或者高致病性的微生物谱图。

　　最近人们提出了一种基于生物信息学策略的微生物质谱鉴定方法^[1,4] 。当对应生物体的基因序列已知时，可根据可能表达的蛋白质序列来预测质谱图中是否存在蛋白生物标记物。蛋白质的序列可以从互联网上的蛋白质组数据库中获得。成功使用该生物信息学方法的条件和要求是数据库的完整性(要包含特殊微生物的基因序列)和真实性(可以预期 / 整合多种蛋白生物标记物的翻译后修饰状态)。目前(2006年初)，已有 280 多种基因序列已知并被公开的细菌基因组(见 www.tigr.org)。