荧光分光光度计及其应用

　　近年来,我国在荧光分光光度分析技术领域的研究取得了许多新的进展。如荧光总发光光谱技术、荧光探针、光纤荧光传感器、激光诱导时间分辨发光技术、荧光薄层扫描技术、动力学荧光法等。因此,对荧光分光光度计的要求不断提高。目前国内生产荧光分光光度计的厂家较少,国外厂商提供的都是中高档的荧光分光光度计。研制和生产性能可靠的国产荧光分光光度计具有重要意义。

　　1　基本原理

　　当激发光照射某些物质时,处在基态的分子吸收激发光后跃迁为激发态,这些激发态分子在因转动、振动等损失一部分激发能量后,以无辐射跃迁下降到低振动能级,再从低振动能级下降到基态,在此过程中激发态分子将以光的形式释放出它们所吸收的能量,这种光称之为荧光,所得到的光谱称为荧光光谱。荧光光谱能够反映荧光物质的特性。荧光分光光度计是基于物质的这种性质而对其进行定性及定量分析的一种分析仪器。

　　荧光定量分析的数学处理比分子吸收光谱复杂。一般来讲,荧光强度If等于分子所吸收辐射的光强度Ia与量子效率的积[1],即If=f·Ia=fI0(1-10-εbc)。如果荧光物质的浓度足够低,则If=2.3fI0εbc=kc。这就是荧光定量分析的理论公式,式中ε、b、c分别是摩尔吸光系数、液池厚度及被测物质的浓度。

　　2　荧光分光光度计的基本结构

　　荧光辐射是从样品发生的,其在所有方向发射都相同,原则上可以从任何角度进行观测。但从仪器设计和应用的观点来看,90°角度是最方便且是目前使用较为广泛的方式。

　　荧光分光光度计的基本结构是:光源→单色器或滤光片→样品池→单色器或滤光片→检测器。

　　目前荧光分光光度计的常用光源为氙灯,单色器多用光栅,检测器主要用光电倍增管,普通荧光分光光度计的激发和发射波长一般在200~900 nm。

　　3　荧光分光光度计的分类

　　3.1　滤光片式荧光计

　　3.1.1　单光束滤光片荧光计

　　单光束滤光片荧光计的工作原理是第1滤光片允许紫外线(激发光)通过,第2滤光片可以透射荧光辐射,但它吸收了任何能向光电池散射的光,对于这类仪器来讲,光电管及灯的稳定性要求比较高,否则会引起较大测量误差。

　　3.1.2　双光束滤光片荧光计

　　贝克曼比例荧光计属于此种类型仪器,它是采用一种特殊设计的汞蒸气灯,具有斩光器作用,使样品和标准各接收60 Hz的相同辐射脉冲并为短的暗间隔所分开,从而保持一个恒定的参比水平。这类仪器消除了由于线路电压波动所引起的变化,具有较高的稳定性。