激光共聚焦显微镜的使用和管理

　　激光扫描共聚焦显微镜(Laser ScanningConfocal Microscope,LSCM)是随着计算机技术和光电技术的飞跃发展,在20世纪80年代后期发展起来的。在生命科学研发中,LSCM技术已经成为生物医学中一个标准的研究工具。目前共聚焦显微镜的功能非常多,好像是一个科研工作站,其应用也大多在生命科学研究领域。围作为大型贵重精密仪器,LSCM 的日常使用的管理需要按照严格的规程来实施,LEICA TCS SP5共聚焦显微镜的使用及管理方法如下。

　　1 了解仪器的组成

　　所有上机操作的人员必须经过培训,了解仪器组成、工作原理和操作规范方可上机。

　　1.1 仪器的组成

　　LEICA TCS SP5主要由四部分组成:(1)显微镜光学系统。为倒置显微镜;镜头包括共聚焦专用平场复消色差10×,20×,40×,63(油镜),100×(油镜) 镜头;(2)扫描装置;(3)激光光源。本机器包含4个激光器:405nm激光 ,氩 离 子 激 光 (457,476,488和 514nm),561nm激光 ,氦氖 633nm激光 ,共四个检测通道;(4)检测系统。整套仪器由计算机控制,各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活进行。由于激光器在工作时散发大量的热,需要风扇降温,突然断电可能烧坏激光器,因此还需要配备稳压电源和不间断供电装备。

　　1.2 工作原理

　　LSCM的工作原理是:照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,激光光源经照明针孔,经由分光镜反射至物镜,并聚焦于样品上,对标本内焦平面上的每一点进行扫描。然后,激发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜,通过探测针孔 时 先 聚 焦 ,聚 焦 后 的 光 被 光 电 倍 增 管(PMT)探测收集 ,并将信号输送到计算机 ,在这光路中,焦平面以外区域射来的光线在检测小孔平面是离焦的,不能通过小孔,只有在焦平面上的光才能穿过探测针孔被观测到。

　　2 清楚机器操作基本步骤

　　(1)打开稳压电源。

　　(2)依次打开电脑桌右侧电脑显微镜 ,扫描器、激光电源开关,将激光开关钥匙顺时针旋转90°至“On-1”位置。(各按钮间隔时间15s以上)。

　　(3)打开显微镜电源及荧光电源。

　　(4)启动徕卡共聚焦软件“LAS AF”。

　　(5)选择合适的物镜、视野。

　　(6“)TL/IL”功能键在明视场和荧光之间切换,通过显微镜前面板的按钮选择合适的荧光滤块,进行样品的荧光观察。

　　(7)工具栏下方Configuration>Laser,根据染料的激发波长,选择所需激光。

　　(8)点击“Aquire”进行光路设置,可改变所选激光、调节激光输出功率、改变分光镜、改变所选PMT、调节PMT检测范围、调节PMT的gain或offset。