共焦显微物镜及其光路对显微Raman光谱仪空间分辨率的影响

　　1 引 言

　　共焦显微术已在拉曼光谱仪中广泛应用。这种仪器不但可以观测样品同一层面(平面)内不同微区的拉曼光谱号，还能分别观测样品内深度不同的各个层面的拉曼信号。这种仪器，在许多测量、研究领域，起着举足轻重的作用^[1]。

　　既然是微区测量，空间分辨率就是至关重要的技术指标。

　　作者已在文献^[1]中详细讨论了点光源照明和共焦针孔对空间分辨率的重要贡献;本文着重讨论显微物镜及其光路的作用。

　　2 显微镜的空间分辨率

　　如图 1，物点 Q 发出的球面波经入射光瞳的衍射，在中间像面形成夫琅和费衍射斑(J.Fraunhofer,1821和1822 年)。我们考虑圆孔的零级衍射斑，即艾里斑(G.B.Airy,1835年)，作为“像点”。艾里斑半径对圆孔(物镜)中心的张角，即艾里斑的角半径，是

　　△θ=1.22^λ/(n′D)        ⑴

　　式中 nˊ为像方折射率，D 为物镜直径,λ为真空中的波长.

　　⑴式和⑵式在不少光学教科书中都可以见到，[2]但它是在非相干光照明的情况下得到的，这在一般教科书中却没有专门指出。

　　相干光照明(例如激光),衍射斑的情况比较复杂,δy会比⑵式计算的结果大些,也就是,系数0.61要改成较大的数。有的作者[3]改成0.77,有的作者[4]改成0.82或1;也许是为了对自己的产品从严要求,有些仪器制造商改成1.22。然而,也有些仪器制造商仍用0.61。

　　如令系数为1.22,λ=514nm,当NA=0.90时(用100×物镜),可由⑵式算出δy=0.57μm。这也就是此时显微镜的横向空间分辨率。

　　3 数值孔径 NA 的重要作用

　　由⑵式可见,用同样的系数(0.61, 1.22或其他),同样的照明(λ相同),NA 愈大,则δ y 愈小即空间分辨率愈高。

　　为了使 NA 尽可能大,总是将显微镜物镜的倍率做得很大,表 1 列出了不同倍率物镜的 NA。

　　4 采样厚度

　　对于任何样品， 用于照明的激光，都有一定的穿透深度;即使不透明样品也是如此， 不过穿透深度很小而已。因而从光轴(Z 轴)方向看，被激光穿透的各层都产生 Raman 散射。采用共焦针孔后，显微镜可对样品在 Z 轴方向分层采样。

　　图 2 ，为采用针孔共焦显微镜观测样品所得的拉曼光谱，所用样品为聚苯乙烯薄膜。由左图可见，其拉曼特征谱线 998cm-1的强度会在物镜沿轴向移动时发生变化。谱线强度变化曲线的半高宽 d(FWHM)对应的显微镜移动距离，也就是Δz，为采样厚度。图2中，Δz =d=2.6μm 。

　　采样厚度Δz 或d是显微镜纵向(轴向)空间分辨率的直接表达。