高效液相色谱法分析纯化合成肽

　　前言

　　多肽合成是蛋白质和多肽化学中一个很活跃的领域，基本合成方法分为液相合成和固相合成两大类。固相合成以液相合成为基础，但更优于液相合成，具有简便、快捷、产率高等优势，1963年由R.B. Mer-rifield^[1]首创，从那时起各种活性多肽的化学合成有了很大的发展^[2]，此法克服了传统方法的弊端，合成步骤简单，为自动合成多肽奠定了基础，逐步成为多肽合成中应用最广泛、效果最佳的方法，广泛用于蛋白质多肽的结构、功能和药理学研究。但是，化学合成多肽时往往会伴随有一系列副反应的发生，不仅影响合成产物的纯度，还可能影响到目标产物的真实性，最终产物成分往往比较复杂，不经纯化很难得到高纯度的目标肽。例如，产物侧链上常结合一些合成过程中没有除掉的化学修饰基团，甚至还含有只比目标产物少一个氨基酸残基的杂质肽链，这是目前固相法合成肽的主要问题之一。近年来已出现了多种多肽及蛋白质纯化技术，如蛋白电泳，离子交换色谱，亲和色谱，分子筛等，但在纯化效果、分离效率等方面都存在一定的局限性，很难解决固相合成肽存在的问题。随着色谱法应用于分析纯化技术的不断发展改进，高效液相色谱法可根据目标肽的合成来源、分子量大小、性质状态等方面从复杂的混合肽产物中分离出单一的目标肽，以其分离效能高，分析速度快，检测灵敏度高，选择性好等独特的优点，成为目前分离纯化多肽的主要手段^[3]。

　　本文基于固相肽合成法的基本原理，合成机制及产物特点等方面，对高效液相色谱法纯化固相合成肽的方法作了较为全面系统的综述，重点介绍了反相高效液相色谱法在分析纯化合成肽中的应用。

　　1 固相肽合成法简述

　　1.1 固相肽合成法的基本原理

　　固相肽合成法是先将所要合成肽链的羧基末端氨基酸的羧基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂(固相载体)相连，然后以结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组分，经过脱去保护基并同过量的活化羧基组分反应接长肽链，根据合成肽的氨基酸个数重复多次的进行下去，即缩合、洗涤、去保护、中和、洗涤，然后进行下一轮缩合，最后达到所需合成肽链的长度。

　　固相合成中氨基酸组分的α-氨基和侧链功能基团均是经过保护基严格保护，以保证它们在激活α-羧基的缩合反应中不会发生副反应。氨基酸的保护主要分为两类，首先是对参与多肽合成的所有氨基酸的α-氨基进行保护，其次是对具有侧链功能基团的氨基酸的侧链进行保护，例如，精氨酸的侧链胍基、赖氨酸的ε-氨基、天门冬氨酸的侧链羧基等在合成中均需要保护。因此，合成后可能切除不完全的保护基便成为固相合成肽分离纯化中的难点和急需解决的问题.