血清样品中胆固醇的携带式测定仪的开发

　　胆固醇是人体内的主要指标之一, 具有重要的生理功能。血液中存在的胆固醇和脂蛋白, 蛋白质, 脂肪酸, 甘油三酯一起形成复合体把胆固醇运到人体所需的部位[ 1] 。复合体的种类可分为超低密度脂蛋白( VLDL) , 低密度脂蛋白( LDL) , 高密度脂蛋白( HDL) 三种。脂蛋白的含量少者叫LDL( low density lipoprotein cholesterol ) , 多者叫HDL( high density lipoprotein cholesterol) . LDL 和动脉硬化, 心肌梗塞, 肾病综合症, 肝胆系统等诸多病有关。因此, 胆固醇和hs-CRP, Lp ( a ) , homocysteine等一起被视为心脏病发作的危险因素指标[ 2] 。

　　人体胆固醇的2/ 3 以酯的形式存在而1/ 3 以游离的形式存在。已报道的胆固醇的测定方法大致可分为酶法和非酶法。利用Liebermann-Burchad反应和利用iron-sal-t acid 方法需要几步骤的沉淀生成和分离过程, 分析所需的时间长, 样品量多, 难于自动化分析[ 3] , 与此相反酶法可用于制动化分析, 广泛用于临床检验。

　　1 原 理

　　胆固醇酯在胆固醇酯化酶的作用下释放出游离的胆固醇, 游离的胆固醇在胆固醇氧化酶的作用下生成过氧化氢, 生成的过氧化氢在HRP 的作用下跟显色剂反应产生颜色的变化。

　　其反应过程用反应式表示如下[ 3]

　　采用荧光显色剂的胆固醇的测定方法有很好的敏感度可检测到ng 级( 纳克级) 水平[ 3, 4] 。目前,商品化的利用显色剂的POCT 型胆固醇测定芯片有Worldwide Medical Corp ( USA) 社的ChoresterolCheck Kit , Healthchecksystems 社的BioScanner 2000Home Blood Testing Kit 等, 而利用荧光的有molecularprobe 社的ELISA 用Cholesterol Assay Kit 之外未有报道。图1 显示了本研究所用的荧光芯片的模型。其反应原理如下。

　　在这里AEC 表示荧光试剂, AECH 表示其还原形式。HRP 失2 个电子形成compound I, compound I从荧光试剂得到1 个电子变为compound II, 又从AEC 得到1 电子变为HRP[ 5] 。生成的自由基状态的AECH* 互相聚合生成聚合物而留在NC 膜的表面, 见图1 所示。

　　2 材料和方法

　　211 试剂和材料

　　Cholesterol oxidase ( EC 1111316, from streptomycessp. ) , cholesterol esterase ( EC 31111. 13, fromstreptomyces sp. ) 购自Sigma( St Louis, MO, USA) , 3-amino-9-ethylcarbazole( AEC) 购自Fluka, horseradishperoxidase( EC 11111117) 购自Kem-En-Tec ( Copenhagen,Danmark) 。胆固醇标准溶液使用了Sigma 试剂。此外的试剂使用了分析纯以上的试剂。制作芯片的nitrocellulose membrane( NC) HF180 是mill-ipore Corp. (Watertown, MA, USA) , 吸收条是Schleicher& Schuell Corp. ( Keene, NH, USA) , 样品条是Pall( New York, USA) 公司的cytosep 1662。

　　212 溶液的配制

　　显色剂AEC 溶液的配制方法如下: AEC-tablets20mg 溶于5 mL 的DMF 冷藏保管, 使用时用2 次蒸馏水稀释10 倍使最终浓度为014 mg/ mL。CE115 mg, CO 310 mg 以及HRP 810 mg 溶于015 ml的2 次蒸馏水并冷藏在- 20 bC 的冰箱里, 使用前稀释5 倍再使用。AEC 溶液的吸收光谱的测定采用了Hewlett packard 8453, 荧光光谱的测定采用了Perkin Elmer LS50B。